杜東東，高美榮，張 波，隋麗英

(亞洲區(qū)域鹵蟲參考中心，天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津300457)

鹵蟲(Artemia)廣泛分布于日曬鹽場和內(nèi)陸鹽湖高鹽水體中，是高鹽生態(tài)系統(tǒng)的主要生物種，一般認(rèn)為鹵蟲屬包含 6個兩性種 A.salina、A.urmiana、A.sinica、A.tibetiana、A.persimilis、A.franciscana 和1個孤雌生殖種群[1-6]．鹵蟲幼體和成蟲是海水苗種極佳的鮮活餌料．初孵的鹵蟲無節(jié)幼體具有大量卵黃，含有豐富的蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，可滿足海水甲殼類和魚類幼體的營養(yǎng)需求．但不同品系和產(chǎn)地鹵蟲卵卵徑大小、營養(yǎng)組成和孵化特性等方面差別較大[7-9]，這些特性與其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用密切相關(guān).

由于鹵蟲休眠卵貯存方便和易于孵化操作而成為世界鹵蟲貿(mào)易的主要商品．水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展對鹵蟲資源的需求日益增加，鹵蟲卵每年的產(chǎn)量大約 3000～4000t(成品干質(zhì)量)，原料主要來自美國、中國、俄羅斯和哈薩克斯坦[10]．中國作為水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，鹵蟲卵年需求量達(dá) 1000～1500t(成品干質(zhì)量).近年來，哈薩克斯坦和俄羅斯成為中國鹵蟲卵原料的主要進(jìn)口國，約占我國鹵蟲卵原料市場 50%，而針對這些新近開發(fā)的鹵蟲資源品系特性研究較少[11-12].本文選取俄羅斯和哈薩克斯坦主要鹽湖的鹵蟲卵進(jìn)行生物學(xué)測定值和營養(yǎng)組分分析，并選取3個產(chǎn)量較大的鹵蟲品系進(jìn)行不同溫度下孵化特性研究，研究結(jié)果對解析中亞地區(qū)鹽湖鹵蟲卵品系特性，促進(jìn)其在水產(chǎn)育苗中有效應(yīng)用具有重要意義．

1 材料與方法

1.1 鹵蟲品系基本信息

本研究所用鹵蟲卵為經(jīng)過去休眠加工的商品鹵蟲卵，基本信息見表1．

表1 鹵蟲卵品系信息Tab. 1 Information of the Artemia cysts

1.2 生物學(xué)指標(biāo)測定

水合卵徑測定：稱取適量鹵蟲干卵放錐形管中，加入 30mL稀釋鹵水(鹽度 3%)，連續(xù)充氣水合 3h.在顯微鏡(Leica DM500)下測定卵徑，每個鹵蟲品系測定100個．

脫殼卵徑測定：向充分水合的鹵蟲卵加入脫殼液脫殼，待鹵蟲卵顏色變?yōu)槌壬礊槊摎ね耆陲@微鏡下測定卵徑，每個鹵蟲品系測定100個．

鹵蟲卵殼厚度(μm)按照式(1)計算．

Ⅰ期無節(jié)幼體體長測定：稱取 0.4g干制鹵蟲卵放置于孵化管中，加入200mL稀釋鹵水(鹽度3%)，水浴控溫28℃，持續(xù)光照(2000 lx)，連續(xù)充氣18h，在顯微鏡下測定Ⅰ期無節(jié)幼體體長，每個品系測定100只．

1.3 孵化率測定

準(zhǔn)確稱取 0.4g鹵蟲卵，置于裝有 200mL人工海水(鹽度 3%)的孵化管中，連續(xù)充氣，持續(xù)光照(2000 lx)，水浴控溫分別為25℃、28℃和31℃，每個品系每個溫度設(shè)置 3個平行．孵化第 12h開始取樣，每4h取樣1次，共取樣7次，至36h結(jié)束．鹵蟲卵孵化率(H)按照式(2)計算．

式中：N表示無節(jié)幼體數(shù)；U表示傘狀幼數(shù)；E表示胚胎數(shù)．

1.4 孵化同步性測定

以測定的最高孵化率為 100%，計算每次取樣的孵化率與最高孵化率的相對值，采用二元二次方程，擬合計算 10%和 90%鹵蟲卵孵化為無節(jié)幼體需要的時間t10和t90，孵化同步性ts按照式(3)計算[14]．

1.5 營養(yǎng)成分測定

參照 GB/T 6432—1994《飼料中粗蛋白測定方法》，稱取干燥的脫殼鹵蟲卵 0.5～0.8g，利用凱氏定氮儀(丹麥FOSS Kjeltec 8400)測定粗蛋白含量．

取0.1g左右脫殼鹵蟲濕卵，準(zhǔn)確加入1mg內(nèi)標(biāo)液(C20∶2n-6，NU-CHEK PREP公司)，向混合物中加入 5 mL甲醇/甲苯混合液(體積比為 3﹕2)，采用高速分散機(jī)破碎組織，再加入新配制的氯乙酰/甲醇混合液(體積比為 1﹕20)水浴 1h(100℃)，最后用正己烷萃取脂肪酸甲酯并濃縮[13]．利用 GC-2014型氣相色譜儀(日本島津公司)對脂肪酸進(jìn)行定性和定量測定．色譜條件：毛細(xì)柱 FFAP；高純氮氣載氣；程序升溫初始溫度60℃，以10℃/min速率升至220℃保持 15min；氣化室溫度 280℃；FID 檢測器溫度280℃；柱壓95.4kPa；分配比率30．

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示．用 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析．采用 One Way ANOVA對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，采用Turkey 多重比較法檢驗，不同字母表示組間存在顯著差異(P＜0.05)．

2 結(jié)果與分析

2.1 鹵蟲卵生物學(xué)指標(biāo)

11個品系鹵蟲卵生物學(xué)指標(biāo)測定值存在較大差異(表 2)，水合卵徑為 251.3～287.1μm，脫殼卵徑為235.5～265.2μm，卵殼厚度為 4.9～12.2μm．綜合分析，除K1(Marandy鹽湖)外，哈薩克斯坦鹵蟲卵水合卵徑和脫殼卵徑均比俄羅斯的卵大．Ⅰ期無節(jié)幼體體長為429.1～500.8μm．

表2 不同品系鹵蟲卵生物學(xué)指標(biāo)(n＝100)Tab. 2 Biometrics of the Artemia cysts(n＝100)

2.2 鹵蟲卵孵化率

Tike鹽湖鹵蟲卵(K3)、Halibiekoe鹽湖鹵蟲卵(K4)和 Kuchuk鹽湖鹵蟲卵品系(R3)不同溫度下的孵化速率如圖1所示．

K3品系在 25、28、31℃下，16h孵化率分別為0.0%、57.3%和 48.7%，28℃孵化率顯著高于其他溫度的(P＜0.05)；24h在 3個溫度下孵化率無顯著差異(P＞0.05)，分別為 84.0%、85.3%和 82.3%；28～36h趨于穩(wěn)定，無顯著變化．

K4品系在 25、28、31℃下，16h孵化率分別為0.0%、37.3%和 15.0%，28℃孵化率顯著高于其他兩個溫度的(P＜0.05)；24h孵化率分別為 84.0%、73.7%和 39.0%，25℃和 28℃孵化率無顯著性差異(P＞0.05)，但均顯著高于 31℃的(P＜0.05)；28～36h，31℃孵化率顯著增加，其他溫度下孵化率趨于穩(wěn)定．

R3品系在 25、28、31℃下，16h孵化率均為0.0%；20h孵化率分別為 0.0%、44.3%和 33.0%，28℃孵化率顯著高于其他兩個溫度的(P＜0.05)；24h孵化率分別為 54.3%、76.0%和 48.0%，25℃和31℃孵化率無顯著差異(P＞0.05)，但均顯著低于28℃的(P＜0.05)；28～36h，25℃和 31℃孵化率顯著增加(P＜0.05)，28℃趨于穩(wěn)定．

2.3 鹵蟲卵孵化同步性

K3、K4和 R3品系鹵蟲卵在不同溫度下孵化同步性見表 3．K3和 K4品系在 25℃同步性較好，R3品系在25℃和28℃同步性較好．

表3 不同溫度下Tike、Halibiekoe和Kuchuk鹽湖鹵蟲卵孵化同步性Tab. 3 Hatching synchrony of Artemia cysts from Tike，Halibiekoe and Kuchuk lakes at different temperatures

2.4 鹵蟲卵粗蛋白和脂肪酸含量

鹵蟲卵粗蛋白和脂肪酸含量(以干質(zhì)量計)測定結(jié)果見表 4．11個品系鹵蟲卵粗蛋白含量為49.19%～54.09%．各品系鹵蟲卵脂肪酸組成及含量差別較大，其中棕櫚酸C16∶0，油酸C18∶1和亞麻酸C18∶3含量普遍較高．11個品系均含有二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA，C20∶5)，含量為0.63～13.24mg/g，其中 K1、K3和 R3含量較低，11個品系均未檢測出二十二碳六烯酸(docose hexaenoie acid，DHA，C22∶6)．

表4 不同品系鹵蟲卵粗蛋白和脂肪酸含量Tab. 4 Crude protein and fatty acid profile of the Artemia cysts

3 討 論

鹵蟲卵孵化率和同步性、卵徑大小、脂肪酸組成和含量等與其在水產(chǎn)育苗中的應(yīng)用密切相關(guān)．孵化率和同步性好、卵徑小和不飽和脂肪酸(PUFA)含量高的鹵蟲卵產(chǎn)品市場價格較高．

鹵蟲卵徑范圍一般在 200～300μm，按照鹵蟲卵卵徑和殼厚度，將鹵蟲卵分為三類[7]：第一類以舊金山鹵蟲卵為代表，卵徑較?。坏诙愐詺W亞大陸的孤雌生殖鹵蟲為代表，卵徑較大；第三類以美國大鹽湖鹵蟲為代表，卵徑中等但卵殼較?。狙芯恐?11個品系鹵蟲卵水合卵徑 251.3～287.1μm，與上述歐亞大陸鹵蟲卵的特性相似．11個品系中 Tike鹽湖品系鹵蟲卵徑和卵殼厚度最大；Marandy、Kezilkak、Karalvoe和Ebeity鹽湖品系卵殼厚度中等，為7.7～8.6μm ；Halibiekoe、Jalmantuze、Big Yarovoe、Kunlundinskoe和Kuchuk鹽湖品系卵殼厚度較小，為4.9～6.0μm，表明卵殼厚度和卵徑大小無明顯相關(guān)性．本研究中除哈薩克斯坦Marandy鹽湖品系外，俄羅斯鹵蟲卵品系水合卵徑和脫殼卵徑稍小于哈薩克斯坦鹵蟲卵品系．

鹵蟲卵的孵化率除了受品系特性影響外，還與去休眠和加工過程有一定關(guān)系．本研究針對經(jīng)過去休眠加工的商品鹵蟲卵進(jìn)行相關(guān)研究．溫度、鹽度和光照是影響鹵蟲卵孵化率的最重要的因素，最適孵化鹽度為 0.5%～3.5%，最適的孵化溫度為 25～28℃，在低于25℃時孵化率降低，在高于33℃時蟲卵代謝幾乎停止[14-15]．孵化同步性是評價鹵蟲卵質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，優(yōu)質(zhì)鹵蟲卵的孵化同步性應(yīng)在 8h之內(nèi)，大于 10h則孵化同步性偏低[14]．孵化同步性高的鹵蟲卵，產(chǎn)出無節(jié)幼體的時段較集中、大小較均一，有利于其作為育苗餌料的使用．從方便應(yīng)用的角度考慮，鹵蟲卵孵化率24h內(nèi)達(dá)到最高為好．Tike鹽湖品系鹵蟲卵在 25、28、31℃溫度下 24h孵化率無顯著性差異(P＜0.05)，說明該品系鹵蟲卵對溫度適應(yīng)范圍廣，且該品系在 25℃孵化同步性為 7.7h，同步性較好．Halibiekoe鹽湖品系鹵蟲卵在 25℃和 28℃下24h孵化率均顯著高于 31℃的(P＜0.05)，說明 K4品系鹵蟲卵適合在較低溫度下孵化，且 25℃孵化同步性較好(8.2h)，說明 25℃為該品系最適孵化溫度．Kuchuk鹽湖品系鹵蟲卵在 28℃下 24h孵化率顯著高于 25℃和 31℃的(P＜0.05)，因此該品系在28℃孵化較好．應(yīng)該指出的是，K3和 K4品系鹵蟲卵在實際測量中，25℃ 16h和28℃ 12h孵化率均為0%，而根據(jù)擬合孵化率方程計算 25℃ t10分別為15.6h和 15.7h，28℃ t10分別為 11.9h和 10.6h，早于實際孵化時間，分析原因可能與方程的擬合度略低相關(guān)．Speer等[16]研究鹵蟲種群特異性顯示，不同產(chǎn)地的 Artemia franciscana鹵蟲卵在不同光照和鹽度下孵化率有顯著差異．王玉清等[17]研究表明，渤海灣鹵蟲卵的最適孵化鹽度為4%～4.5%，在鹽度低于2%或高于 5.5%時孵化率均顯著降低．本研究中分析的3個產(chǎn)量較大品系鹵蟲卵在不同溫度下孵化特性存在顯著性差異，可能與鹵蟲對不同鹽湖產(chǎn)地的非生物環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)．

鹵蟲的營養(yǎng)組成與其餌料來源和生長環(huán)境有關(guān)，不同品系鹵蟲的營養(yǎng)組成有較大差別[14,18]．鹵蟲作為生物餌料的營養(yǎng)價值主要在于它含有較高的蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸．鹵蟲及鹵蟲卵粗蛋白含量一般為40%～60%[13,19-20]，且含量與鹵蟲品系、發(fā)育階段以及餌料相關(guān)，隨著鹵蟲的生長，粗蛋白有增加的趨勢[18].本研究中哈薩克斯坦和俄羅斯品系鹵蟲卵粗蛋白差異不顯著，約占脫殼鹵蟲干卵的 50%．除西藏鹵蟲品系 EPA 含量較高(19.22～46.4mg/g)及含有少量DHA，其他鹵蟲品系 EPA 含量一般小于 15.4mg/g，而 DHA 普遍缺乏[13-14,21]．本研究中 11個品系鹵蟲卵(均以干質(zhì)量計)粗蛋白含量為 49.19%～54.09%，脂肪酸含量為 92.81～144.86mg/g．所有鹽湖品系均含有EPA且差異較大，Kuchuk鹽湖品系含量較低為0.63mg/g，Jalmantuze鹽湖品系含量較高為13.24mg/g．所有品系鹵蟲卵均不含有 DHA．高度不飽和脂肪酸(highly unsaturated fatty acid，HUFA)，尤其是EPA和DHA，是海水魚和甲殼類幼苗必需的脂肪酸[14,22]．對于不同品系鹵蟲卵營養(yǎng)組成差異以及EPA和DHA普遍較低或不存在的狀況，可通過營養(yǎng)強(qiáng)化或生物包裹提高鹵蟲無節(jié)幼體的 HUFA含量. 經(jīng)過 24h強(qiáng)化，n-3HUFA可以達(dá)到 50～60mg/g[23-24]. 強(qiáng)化后的鹵蟲作為餌料投喂水產(chǎn)幼苗，可促進(jìn)幼苗存活生長和抗病力．

本研究中涉及的哈薩克斯坦和俄羅斯鹵蟲卵卵徑偏大，卵殼厚度有較大差異，說明與鹵蟲卵徑大小無關(guān)．溫度影響鹵蟲卵的孵化率和速率，Tike、Halibiekoe和Kuchuk鹽湖的鹵蟲卵在不同溫度下孵化率和同步性有較大差異．Tike鹽湖鹵蟲卵適應(yīng)溫度范圍較廣，孵化同步性均較好，均低于 10h. Hali-biekoe鹽湖品系適于較低溫度孵化，在 25℃孵化同步性較好，為 8.2h，且該鹽湖鹵蟲卵 EPA 含量較高.Kuchuk鹽湖品系適于28℃孵化，同步性為8.6h．