景贊，劉超，劉曉碧

（樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川樂山 614000）

甜蜜素是一種人工合成的甜味劑，在食品工業(yè)生產(chǎn)中具有甜度高、用量少、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，因而應(yīng)用廣泛。GB 2760 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)甜蜜素的使用范圍和限量都有明確規(guī)定，但分析近幾年國家公布的抽檢數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，甜蜜素濫用問題比較突出，白酒、饅頭中檢出較多，食品安全形勢(shì)依然嚴(yán)峻，對(duì)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的能力要求也越來越高[1-3]。

能力比對(duì)作為一種提升檢測(cè)水平的手段在質(zhì)量控制中較為常見，通過比對(duì)考核能夠發(fā)現(xiàn)和檢驗(yàn)各環(huán)節(jié)中的干擾因素，評(píng)估其對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響大小，識(shí)別實(shí)驗(yàn)室中的問題并制定相應(yīng)的措施，從而提升檢測(cè)機(jī)構(gòu)的能力水平[4-7]。本文著眼于蘋果汁中的甜蜜素含量測(cè)定，分別采用氣相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過此次考核加強(qiáng)食品安全檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.7%，購于壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；正庚烷，色譜純；賽默飛世爾科技（中國）有限公司；亞硝酸鈉、硫酸、氯化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀，7890A，安捷倫科技中國有限公司；液質(zhì)聯(lián)用儀，API3200，AB SCIEX 公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 氣相法

稱取甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用超純水稀釋至1 000 μg/mL，準(zhǔn)確移取0.25、0.50、1.00、2.00、2.50、4.00 mL 于25 mL 容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，得到濃度為10、20、40、80、100、160 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3.2 液質(zhì)法

準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 μg/mL）1.00 mL 于100 mL 容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，得到濃度為10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，分別移取0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL 至10 mL 容量瓶中，用超純水定容，得到濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 氣相法

蘋果汁試樣搖勻后稱取10.000 0 g，用水定容至25 mL，準(zhǔn)確移取10.0 mL 試樣于50 mL 帶蓋離心管中。置于冰浴10 min 后，加入5.0 mL 正庚烷，分別加入2.5 mL亞硝酸鈉和硫酸溶液，蓋緊蓋子，搖勻，在冰浴中放置30 min，其間振搖5 次。加入2.5 g 氯化鈉，蓋上蓋子后振搖80 次，低溫離心（3 000 r/min）10 min 分層，取上清液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾后待測(cè)定。

1.4.2 液質(zhì)法

蘋果汁試樣搖勻后，稱取1.000 0 g，用水定容至100 mL搖勻，取1 mL 定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm 水相微孔濾膜過濾后待測(cè)定。

1.5 儀器條件設(shè)置[8]

1.5.1 氣相法

進(jìn)樣口溫度：220 ℃，分流比：10:1；色譜柱：HP-5 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；柱溫箱升溫程序：初始溫度60 ℃（保持2 min），以10 ℃/min 升至90 ℃（保持0.5 min），再以20 ℃/min 升至230 ℃，保持3 min；流速：2 mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL；載氣：高純氮?dú)?；FID 檢測(cè)器溫度：260 ℃。

1.5.2 液質(zhì)法

（1）液相條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 mm）；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相:甲醇、10 mmol/L 乙酸銨溶液。

梯度洗脫：0.01 min，5%甲醇；0.01～5.00 min，甲醇5%～15%；5.00～8.00 min，甲醇15%～30.0%；8.00～9.00 min，甲醇30.0%～80.0%；9.00～13.00 min，甲醇80.0%～80.0%、13.00～13.10 min，甲醇80.0%～5.0%；13.10～15.00 min，甲醇5.0%～5.0%。

（2）質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子模式；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；霧化氣、氣簾氣、輔助加熱器、碰撞氣均為高純氮?dú)?；IS：-4 500 V；GS1：30 Psi；CUR：30 Psi；GS2:30 Psi；溫度：500 ℃；CAD：110 mL/min。具體質(zhì)譜條件見表1。

表1 甜蜜素質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MRM parameters of sodium cyclamate

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法的選擇

目前檢測(cè)甜蜜素的方法有氣相色譜法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法，氣相和液相法均需要衍生化，液質(zhì)法純水稀釋后直接測(cè)定，從前處理看液質(zhì)法有很大優(yōu)勢(shì)?？紤]到對(duì)比衍生化和未衍生、色譜與質(zhì)譜，最終選擇氣相色譜和液質(zhì)聯(lián)用法[9-11]。甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1、2。

2.2 影響分析結(jié)果的因素和關(guān)鍵控制點(diǎn)

標(biāo)準(zhǔn)品要穩(wěn)定、來源可靠，且要求帶有檢驗(yàn)報(bào)告證書，同時(shí)按照標(biāo)明的儲(chǔ)存條件進(jìn)行存放，使用前溫度應(yīng)恢復(fù)至室溫。能力考核樣接收時(shí)是冷藏狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)存放在冷藏環(huán)境中，在使用前恢復(fù)至室溫并充分混勻。檢測(cè)過程中用到的移液器、容量瓶、移液管等器具應(yīng)檢定校準(zhǔn)，如無法校準(zhǔn)檢定應(yīng)通過自校，保證器具的準(zhǔn)確性[12]。氣相法測(cè)定中衍生環(huán)境的控制尤為重要，移取10 mL樣品至離心管預(yù)冷階段應(yīng)盡可能長，衍生溫度最好控制在10 ℃以下，同時(shí)對(duì)冰浴水溫的均一性也要注意，可以購買帶循環(huán)水功能的冰浴設(shè)備，否則應(yīng)間隔攪動(dòng)，防止水溫不均造成衍生效果不好。氣相色譜襯管的清潔程度會(huì)影響目標(biāo)物的響應(yīng)值，檢測(cè)時(shí)應(yīng)及時(shí)更換，同樣液質(zhì)離子源也應(yīng)及時(shí)維護(hù)清潔。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，盡量不要使用儀器自動(dòng)稀釋功能，可能會(huì)帶來較大的偏差。樣品基質(zhì)的影響在檢測(cè)中也不能忽略，試驗(yàn)考察了蘋果汁基質(zhì)配標(biāo)與純?nèi)軇┡錁?biāo)的差異性，結(jié)果顯示兩者峰面積近似，帶來的偏差很小。

2.3 方法的線性關(guān)系

以濃度為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在所測(cè)定濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，結(jié)果見表2。

表2 甜蜜素的線性范圍Table 2 Linear range of sodium cyclamate

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

將能力考核樣平均分成10 份，按照上述氣相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法前處理方法進(jìn)行提取測(cè)定，結(jié)果見表3。

將兩種方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，樣本量n＝10，自由度df＝9，雙側(cè)檢驗(yàn)α＝0.05，計(jì)算結(jié)果P＞0.05。統(tǒng)計(jì)上沒有顯著性差異，可以認(rèn)為氣相色譜法與液質(zhì)聯(lián)用法在測(cè)定蘋果汁甜蜜素時(shí)結(jié)果間無顯著性差異。

2.5 統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析

此次能力考核參加單位共有15 家，統(tǒng)計(jì)結(jié)果數(shù)據(jù)采用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)法，包括計(jì)算結(jié)果數(shù)、中位值、標(biāo)準(zhǔn)化四分位距、穩(wěn)健變異系數(shù)、最小值、最大值和極差。再根據(jù)中位值和標(biāo)準(zhǔn)化四分位距計(jì)算出實(shí)驗(yàn)室間Z比分?jǐn)?shù)（ZB）和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)Z比分?jǐn)?shù)（ZW），依據(jù)Z比分?jǐn)?shù)評(píng)定實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，定義為|Z|≤2 為滿意，2＜|Z|＜3 為可疑，|Z|≥3 為不滿意[9]。蘋果汁中甜密素測(cè)定的ZB、ZW柱狀圖見圖3、4。

表3 氣相法和液質(zhì)法結(jié)果比較Table 3 Comparison of testing results by GC and LC-MS/MS

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)室ZB、ZW值均小于2，結(jié)果較為滿意，參加能力考核的15 家實(shí)驗(yàn)室中，其中1 家結(jié)果可疑，2 家結(jié)果為不滿意，實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)可疑或者不滿意結(jié)果時(shí)，可以從影響結(jié)果因素和關(guān)鍵控制點(diǎn)分析產(chǎn)生問題的原因，建立相關(guān)糾正措施，做好標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和試劑的驗(yàn)收保管，加強(qiáng)人員業(yè)務(wù)培訓(xùn)，規(guī)范儀器設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)，對(duì)新方法、新儀器的使用進(jìn)行集中培訓(xùn)學(xué)習(xí)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)部質(zhì)控也很重要，通過購買相應(yīng)的質(zhì)控樣進(jìn)行處理，是保證結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定的有效手段。

3 討論

本文分別采用氣相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定蘋果汁中甜蜜素含量，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，同時(shí)從自身實(shí)驗(yàn)室角度，總結(jié)了甜蜜素檢測(cè)環(huán)節(jié)中的影響因素和關(guān)鍵控制點(diǎn)，對(duì)于能力驗(yàn)證出現(xiàn)可疑或者不滿意結(jié)果的其它實(shí)驗(yàn)室可作為參考，建立相關(guān)的糾正和預(yù)防措施，不斷提升實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力水平。