黃麗華　陳詩敏　陳剛

摘 要：本試驗(yàn)研究赪桐葉中總黃酮的提取工藝及體外抗氧化活性。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)化其總黃酮提取的工藝，并測定赪桐葉的黃酮的抗氧化能力。結(jié)果表明：赪桐葉的黃酮提取最佳工藝為乙醇濃度80%，料液比1∶30（g/mL），提取時間20min，赪桐葉片總黃酮提取率為4.13%;在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黃酮總還原能力隨著濃度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)黃酮濃度為1mg/mL時，黃酮對DPPH·和·OH的最大清除率分別為87.2%和86.5%，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：赪桐葉;黃酮;提取工藝;抗氧化活性

中圖分類號：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

赪桐（Clerodendrum japonicum（Thunb.）sweet），又稱百日紅、貞桐花、狀元紅、荷苞花和紅花倒血蓮，為馬鞭草科赪桐屬多年生植物，花艷麗如火，花期長[1]。在我國主要分布于廣東、廣西、貴州及臺灣等地，國外主要分布于日本、印度、馬來西亞等地區(qū)和國家。赪桐的根、葉可入藥，根具有祛風(fēng)利濕，散瘀消腫的功效，用于治療風(fēng)濕骨痛，腰肌勞損，跌打損傷，肺結(jié)核咳嗽、咯血等;葉具有解毒排膿的功效，可外用治療瘡癤腫[2]。赪桐根含有鞣質(zhì)、皂苷、黃酮類、酚類、香豆素與內(nèi)酯、三萜類和揮發(fā)油等化學(xué)成分[3]。前期研究表明，赪桐根水提取物對急慢性炎癥有抗炎的作用[4];通過對赪桐根中總黃酮的提取優(yōu)化[5]，表明赪桐根含有一定黃酮成分。黃酮是一種強(qiáng)抗氧化劑，可有效清除體內(nèi)的氧自由基[3]。

目前對于赪桐葉的化學(xué)成分及有效成分的分析還比較缺乏，為了深度挖掘赪桐的潛在藥用價值，滿足地方藥用資源缺乏的迫切需要，本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，篩選赪桐葉片總黃酮提取的條件，測定黃酮含量及黃酮總還原能力，并測定其清除DPPH·和·OH的能力，系統(tǒng)評估其抗氧化活性，旨在為赪桐葉中黃酮成分的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

赪桐新鮮葉片：采摘于肇慶學(xué)院生物園，烘干粉碎備用。

蘆丁、無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、亞硝酸鋁、磷酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、DPPH、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸等，試劑均為國產(chǎn)分析純。

電子天平（FA2004A，上海精科）;真空泵（ZKJ-1型，上海）;超聲波清洗器（KQ5100SD，昆山）;可見分光光度計（722型，上海精科）;干燥箱（ED-115型，上海一恒）等。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

赪桐葉片粉末→加入乙醇溶液→浸泡4h→超聲波提取→減壓抽濾→總黃酮提取液→進(jìn)行含量測定及抗氧化活性測定及分析[5]。

1.2.2 單因素試驗(yàn)[6]

在維持其它條件不變的條件下，分別測定不同浸取液濃度（40%、50%、60%、70%、80%）乙醇、料液比（1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶35，單位為g/mL）、提取時間（10min、20min、30min、40min、50min）各因素對黃酮含量提取的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)[7]

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇體積濃度、料液比、提取時間3個因素采用L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)化總黃酮提取的工藝，并根據(jù)優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.4 赪桐總黃酮含量的測定

總黃酮含量采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測定，精確稱量10.0mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于小燒杯中，用70%乙醇溶液溶解，并轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，定容至刻度，得到0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL于25mL容量瓶中，各加水6mL，加入5%NaNO2溶液0.7mL，搖勻，靜置6min;加5%Al（NO3）3溶液0.7mL，搖勻，靜置6min;加1.0mol/L NaOH溶液5mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置6min。在510nm波長下測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密吸取赪桐葉總黃酮提取液0.5mL至25mL容量瓶中，加水6.0mL，按上方方法顯色后在510nm處測定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和稀釋倍數(shù)計算樣品溶液中總黃酮含量。

1.3 赪桐葉片總黃酮的抗氧化活性

1.3.1 黃酮總還原能力的測定

取不同質(zhì)量濃度（0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL）的赪桐葉片總黃酮提取液2.5mL，加pH6.6的磷酸緩沖液（0.2mol/L）2.5mL及1%鐵氰化鉀1mL，50℃水浴20min，加10%三氯乙酸2.5mL，3000r/min離心10min。取上清液2.5mL，加2.5mL蒸餾水、0.5mL 0.1%三氯化鐵，在波長700nm處測定其吸光度值[8]。

1.3.2 黃酮對DPPH·清除能力的測定

取不同質(zhì)量濃度（0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL）的總黃酮提取液各1mL于刻度試管中，加入0.04mg/mL DPPH甲醇溶液5mL，25℃條件下避光靜置60min，于517nm處測定吸光度Ax，以1mL 50%乙醇為空白測定吸光度A0，未加DPPH的樣品溶液測定吸光度Ax0[9，10]。DPPH·清除率通過公式計算：

DPPH·清除率/%=A0-（AX-AXO）A0×100%

1.3.3 黃酮對·OH清除能力的測定

取不同質(zhì)量濃度（0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL）的總黃酮提取液各2mL于刻度試管中，再分別加入6mmol/L FeSO4、6mmol/L H2O2、6mmol/L水楊酸-乙醇溶液各2mL，將其放入37℃水浴鍋中35min，待測液在波長510nm處測定吸光度Ax。以2mL去離子水為空白測得吸光度A0，未加入H2O2的溶液的吸光度為Ax0[11]。按以下公式計算·OH清除率：

·OH清除率/%=A0-（AX-AXO）A0×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)測定，由圖1得出回歸方程為Y=6.1339X+0.0045，R2=0.9994，在0～0.08mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對赪桐葉片總黃酮得率的影響

乙醇濃度對赪桐葉片黃酮提取液的影響見圖2。由圖2可知，赪桐葉總黃酮得率隨著乙醇濃度增加呈先升高后下降的趨勢，在乙醇濃度為70%時，總黃酮提取量最高達(dá)5.6%，乙醇濃度繼續(xù)增加，其總黃酮得率逐漸下降，乙醇濃度為80%時，總黃酮得率為4.5%。根據(jù)相似相溶原理，赪桐葉總黃酮的極性與70%的乙醇溶液相近，在中等乙醇濃度溶液中溶解度較高，在高乙醇濃度溶液中溶解度較低。因此，赪桐葉片黃酮提取最適宜乙醇濃度為70%。

2.2.2 料液比對赪桐葉片總黃酮得率的影響

料液比對赪桐葉片黃酮得率的影響見圖3。由圖3可知，赪桐葉總黃酮得率隨著液料比的增加而快速升高，當(dāng)液料比達(dá)到1∶25（g/mL）時，總黃酮得率最高達(dá)3.7%，再增加液料比時，總黃酮提取量緩慢下降。液料比小，提取液中赪桐葉總黃酮過飽和，提取量降低。液料比增加，溶液與物料中的黃酮濃度差增大，由溶解平衡原理可知，黃酮提取量增加。但液料比過大，可能會改變提取液極性而降低部分黃酮成分的溶解性，再增加液料比時，總黃酮提取量緩慢下降。因此，赪桐葉片黃酮提取最佳料液比為1∶25（g/mL）。

2.2.3 超聲提取時間對赪桐葉片總黃酮得率的影響

超聲提取時間對赪桐葉片黃酮得率的影響見圖4。由圖4可知，赪桐葉總黃酮得率先隨提取時間的增長而升高，提取20min時總黃酮得率最高達(dá)2.6%，此后總黃酮提取量緩慢下降，但總體差異不明顯。因此，20min為適宜提取時間。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

本正交試驗(yàn)以赪桐葉片黃酮得率為結(jié)果的評價指標(biāo)[2]。其中，所提取黃酮的得率受乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲提取時間（C）3個因素的交叉影響。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

從以上正交試驗(yàn)結(jié)果對比計算得出極差R值，極差差異最大的是料液比，說明料液比對赪桐葉片黃酮提取影響最顯著，其次是提取時間;極差最小的是乙醇濃度，說明乙醇濃度對赪桐葉片黃酮提取的影響最小。對比3個因素，主次排序?yàn)锽料液比>C提取時間>A乙醇濃度，超聲輔助提取赪桐葉片黃酮的最佳條件為A3B3C2，即80%的浸取液濃度、1∶30（g/mL）的料液比、20min的提取時間。

2.4 最佳提取條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最佳組合條件下進(jìn)行提取赪桐葉片總黃酮測定，結(jié)果見表3，所提取的黃酮得率為4.13%。3次平行測定得率均大于正交試驗(yàn)最佳組合所測得率3.94%，因此A3B3C2，即80%的乙醇濃度、1∶30（g/mL）的料液比、20min的提取時間為本試驗(yàn)的最優(yōu)組合。

2.5 赪桐葉片總黃酮提取液的抗氧化活性分析

2.5.1 赪桐葉片總黃酮提取液的總還原力

如圖5所示，試驗(yàn)采用Oyaizu法，通過觀察添加不同濃度的黃酮提取液后Fe3+和Fe2+之間的轉(zhuǎn)移來檢測樣品的還原能力，因?yàn)橐环N物質(zhì)的還原能力與其潛在的抗氧化活性關(guān)系密切。黃酮提取液具有一定的總還原力，隨著樣品濃度的增加，吸光度增大，兩者呈劑量依賴關(guān)系，吸光度越高，還原能力越強(qiáng)[12，13]。樣品濃度（X）與吸光度（Y）間的回歸方程為Y=3.8609X+0.1456，R2=0.9999。

2.5.2 赪桐葉片總黃酮提取液對DPPH·的清除作用

由圖6可知，黃酮提取液對DPPH·有較強(qiáng)的清除作用，在質(zhì)量濃度為0.125～1.00mg/mL范圍內(nèi)隨著樣品濃度的增加，清除率逐漸增加，并呈明顯的量效關(guān)系，最大清除率為87.2%。

2.5.3 赪桐葉片總黃酮提取液對·OH的清除作用

在人體中，羥自由基是活性氧自由基的一種，因此測定總黃酮提取液對羥自由基清除率能反映出該物質(zhì)的抗氧化活性能力[3]。由圖7可見，赪桐葉片的總黃酮提取液對羥自由基的清除能力隨著濃度升高而增強(qiáng)。當(dāng)黃酮濃度為1mg/mL時，黃酮提取液對羥基自由基的清除率高達(dá)86.5%，證明其在體外抗活性氧基團(tuán)的能力強(qiáng)，抗氧化活性表現(xiàn)較明顯。

3 結(jié)論

上述研究可得知，浸取液濃度、料液比、浸取時間等因素對赪桐葉片黃酮的提取有一定的影響，且料液比影響較為顯著。通過L9（34）正交試驗(yàn)法對赪桐葉片中黃酮的工藝流程參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果最優(yōu)組合為乙醇濃度80%，料液比1∶30（g/mL），提取時間20min。最優(yōu)組合下赪桐葉片總黃酮提取率達(dá)4.13%。秦祖杰[5]的研究表明赪桐根中含有總黃酮的含量為0.66%，兩者比較表明，赪桐葉中的黃酮含量比根更為豐富。本研究所優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可行、提取率高。

針對于赪桐葉子黃酮的研究鮮有報道，這不僅不利于對中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究，還不利于對中國自然資源的再利用。通過對赪桐葉黃酮的研究，測定赪桐葉黃酮的活性，有助于了解其成分功效，開發(fā)其潛在價值，研發(fā)出新的產(chǎn)品，將其工業(yè)化，擴(kuò)大赪桐潛在市場，并以此帶動傳統(tǒng)農(nóng)產(chǎn)品和中藥材的附加價值再利用。

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（責(zé)任編輯 賈燦）