劉強欣　張虹　胡云強　聞佳鈺　陳瑜　吳丹虹　何曉明

摘要 [目的]建立植物油中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定方法。[方法]以QuEChERS為基礎，樣品經乙腈-水（80∶20，V/V）提取，采用EMR-Lipid凈化，以ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）分離后，在電噴霧離子源的負離子模式下，多反應監(jiān)測模式采集數(shù)據(jù)，外標法分量。[結果]在10～1 000 μg/L香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素這3種化合物線性關系良好，相關系數(shù)（r）為0.993～0.998。[結論]該方法簡單、準確、靈敏、快速，適用于植物油中3種香精的測定。

關鍵詞 QuEChERS;香蘭素;甲基香蘭素;乙基香蘭素;高效液相色譜-串聯(lián)質譜法;植物油

中圖分類號 TS207.3文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）11-0198-04

Abstract [Objective]A liquid chromatographytandem mass spectrometric（LC-MS/MS）method was developed for the simultaneous determination of vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin in vegetable oils.[Method]The sample was extracted with acetonitrile-water（80∶20，V/V），cleared up by EMRLipid.The separation of target compounds were performed on an ACQUITY UPLC HSS T3 column（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）.Then the sample were ionized using Electrospray ionization （ESI），examined under multiple reaction monitoring（MRM） mode and quantified by the external standard method.[Result]The linear ranges of vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin were 10-1 000 μg/L，with correlation coefficients（r） of 0.993-0.998.[Conclusion]It is simply，accurate，sensitive and quick for the detection of three essnces in vegetable oils.

Key words QuEChERS;Vanillin;Methyl vanillin;Ethyl vanillin;High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry;Vegetable oils

香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素是食品中常見的食用香料，其中香蘭素是天然存在于咖啡、蘆筍和香蘭莢中，后兩者是人工合成的化合物。它們是一種允許添加的食品添加劑，在糖果、餅干、糕點和飲料中被廣泛應用。但有相關文獻表明過量食入香精可導致頭痛、惡心、嘔吐、呼吸困難，甚至會損傷肝腎[1]。植物油是由不飽和脂肪酸和甘油化合而成的化合物，廣泛分布于自然界中，是從植物的果實、種子、胚芽中得到的油脂（如菜籽油、大豆油和花生油等）。我國是植物油消費大國，植物油是一種生活必需品，人們每天通過各種形式攝入植物油，隨著我國改革開放和國民經濟的發(fā)展，人們生活水平日漸提升，食品產品安全意識逐步提高，并且依據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》規(guī)定植物油脂是不得添加食用香料、香精，因此植物油中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的檢測就很有意義了。

目前，對于香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定方法有紫外分光光度法[2]、高效液相色譜法[3]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[4-5]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[6-7]等。高效液相色譜-串聯(lián)質譜法具有準確、高選擇性和高靈敏度的特點，在食品分析領域被廣泛應用。該試驗采用改進Quick Easy Cheap Effective Rugged（QuEChERS）方法凈化，結合高效液相色譜-串聯(lián)質譜法用于植物油中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑。樣品為市售植物油。甲酸、乙腈和甲醇（HPLC級，美國Thermo公司）; 增強型基質去除吸附劑（EMR-Lipid，美國Agilent公司）;十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）（天津博納艾杰爾科技有限公司）;試驗用水為Milli-Q超純水;其他試劑均為國產分析純試劑。香蘭素（含量98.8%），美國CATO公司; 甲基香蘭素（含量98.3%），上海ANPEL公司;乙基香蘭素（含量99.9%），上海ANPEL公司。

1.1.2 儀器與設備。三重四級桿液相色譜/串聯(lián)質譜儀（LC-MS/MS 8050，日本Shimadzu公司）;多管渦旋混合儀（DMT-2500，杭州米歐儀器有限公司）;高速冷凍離心機（ST16R，美國Thermo公司）;超純水機（美國Millipore 公司）;超聲波清洗器（KQ-500E，500 W，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制。

用甲醇分別配制香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的10 mg/L的單標儲備溶液，于-18 ℃ 下避光保存。用時根據(jù)需要用空白基質提取液逐級稀釋配成適當濃度的混合標準工作液。

1.2.2 樣品前處理。

稱取1.00 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 80%乙腈溶液渦旋混勻，超聲提取10 min， 8 000 r/min離心 3 min，移取4 mL上清液置于0.5 g EMR-Lipid 凈化管中（使用前用2 mL水充分潤濕活化），渦旋振蕩2 min，8 000 r/min 離心3 min，轉移凈化液至已提前加入0.5 g氯化鈉和1.0 g無水硫酸鈉的10 mL離心管中，渦旋振蕩2 min，8 000 r/min 離心3 min，將凈化液移入10 mL離心管中，40 ℃下氮吹至干，加入1.0 mL 初始流動相渦旋溶解殘留物，過0.22 μm濾膜，待測。

1.2.3 色譜條件。

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;進樣量3 μL;柱溫35 ℃;流動相為0.1%氨水溶液（A）和甲醇（B）;流速為0.3 mL/min;流動相梯度程序見表 1。

1.2.4 質譜條件。

電噴霧離子源（ESI），溫度400 ?℃，毛細管電壓3 000 V;掃描方式：負離子模式;霧化氣流量：3.0 L/min;加熱氣流量：10.0 L/min;定性與定量離子對、碰撞能量等參數(shù)見表 2。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

3種化合物的化學結構式上同時具有羥基和醛基，因此分別在正、負離子模式下對濃度為1.0 mg/L化合物的標準溶液進行全掃描。結果表明，3種化合物均能產生[M+H]+以及[M-H]-的準分子離子，但在負離子模式能夠提供更多的碎片信息。在此基礎上，進行二級質譜掃描，并根據(jù)EU第657/2002/EC號決議中有關規(guī)定中有關質譜分析方法必須不少于4個識別點的規(guī)定，選擇2對質譜響應最佳的監(jiān)測離子對及相應參數(shù)作為最終質譜采集參數(shù)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

采用負離子模式分析樣品時，在流動相中加入適量的堿性物質可提高化合物的離子化效率。該試驗考察了甲醇-0.1%氨水和乙腈-0.1%氨水這2種流動相體系在相同梯度洗脫條件下對3種化合物的分離度、靈敏度和峰型的影響。結果表明，采用甲醇-0.1%氨水作為流動相，化合物具有更好的分離效果和響應值， 3種化合物總離子流色譜圖見圖1。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化。

香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素均屬于弱極性化合物，甲醇、乙腈是常用的提取溶劑。該試驗比較了甲醇、乙腈2種提取溶劑對化合物提取效率的影響。結果表明，乙腈的提取效率較好，且提取液帶出的油脂雜質較少[8-12]，提取液顏色更清澈，便于后續(xù)凈化。

由于植物油樣品與乙腈互溶性不佳，直接用乙腈提取存在分散不夠完全的現(xiàn)象。為改善提取效果，在提取時加入一定量水，不但可以分散樣品，又提高了乙腈對于樣品的滲透性，從而改善提取效率[13]。該試驗進一步對體積分數(shù)為60%、70%、80%、90%乙腈溶液和純乙腈5種提取試劑進行了比較。結果表明（圖2），當提取溶劑中乙腈體積分數(shù)為80%時，提取效率最高。因此選擇80%乙腈溶液作為提取溶劑。

2.3.2 提取時間的優(yōu)化。

比較不同的超聲時間（5、10、20、30 min）對3種化合物提取效率的影響，結果顯示（圖3），在超聲提取10 min時可獲得較好的回收率，繼續(xù)增加超聲時間，提取效率無明顯差異。因此選擇超聲10 min提取樣品。

2.3.3 吸附劑的優(yōu)化。

植物油中主要的基質干擾為脂類物質，這些雜質的存在會干擾化合物的測定，影響方法的靈敏度、精密度和準確度。因此選擇合適的吸附劑來去除雜質以降低基質效應（ME）對檢測結果的影響，成為QuEChERS方法的關鍵。該試驗為考察C18、PSA和EMR-Lipid這3種吸附劑的凈化效果，分別將QuEChERS方法中常規(guī)用量0.5 g C18、PSA和EMR-Lipid凈化劑分別加入到4 mL加標濃度為50 μg/kg的植物油提取液中，以ME值評價3種吸附劑的凈化效果，ME=（基質加標溶液響應值/空白溶劑中加標溶液響應值）×100%。

結果表明，EMR-Lipid凈化效果優(yōu)于C18、PSA（圖4）。這可能是與傳統(tǒng)吸附劑C18、PSA相比，特殊聚合物基質EMR-Lipid是一種針對油脂類成分設計的增強型脂質去除凈化劑，能夠專門吸附長鏈結構脂類物質，選擇吸附性好，能有效降低高脂肪含量基質對目標成分的干擾。

為確定EMR-Lipid的合適用量，該試驗進一步對0.25、0.50、0.75、1.00和1.25 g EMR-Lipid的凈化效果進行比較。結果表明，當EMR-Lipid用量為0.50 g時，化合物回收率均大于80%，繼續(xù)增加EMR-Lipid用量，其回收率之間沒有顯著差異。因此最終選擇0.5 g EMR-Lipid作為吸附劑的合適用量。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線與檢出限。

在優(yōu)化的條件下進行了方法學驗證。配制系列濃度的基質匹配混合標準工作溶液，以化合物的質量濃度（X，μg/L）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線。結果表明（表3），在10～1 000 μg/L 3種化合物線性關系良好，相關系數(shù)（r）為0.993～0.998。采用標準添加法進行測定，以3倍信噪比確定樣品檢出限（LOD），10倍信噪比確定方法定量限（LOQ），得到3 種化合物的檢出限為9.2～11.4 μg/kg，定量限為30.4～37.6 μg/kg。

2.4.2 回收率與精密度。為考察該試驗的可行性，向空白菜籽油、大豆油和花生油樣品中添加高、中、低3個水平的混合標準溶液，每組做6個平行，結果發(fā)現(xiàn)（表4），在優(yōu)化的試驗條件下不同油品的平均回收率在72.8%～91.8%，RSD為1.6%～8.6%，準確度與精密度能滿足實際分析的要求。

2.5 與國標方法的比較

香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素這3種化合物現(xiàn)有國標方法為BJS 201705《食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定》，該國標方法中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素檢出限均為30.0 μg/kg，定量限均為100.0 μg/kg。該方法檢測香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的檢出限明顯低于上述國標方法。同時在樣品前處理上，相對于國標方法，該方法對于提取溶劑、提取時間、吸附劑進行了優(yōu)化，并且操作簡方便、回收率高。

3 結論

該研究建立了植物油中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法方法，通過改良QuEChERS方法，使得香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素在植物油中的提取效率、靈敏度均顯著提高，優(yōu)于國標方法。該方法簡單、準確、靈敏、快速，可滿足植物油中的香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的快速測定要求。

參考文獻

[1] 楊華梅，杭莉.超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定食品中4種常用香精[J].色譜，2015，33（3）：250-255.

[2] 馮彩婷，楊麗霞，李書靜.紫外-可見分光光度法測定奶粉中的香蘭素含量[J].河北化工，2012，35（6）：78-80.

[3] 劉祥萍，黃薇.高效液相色譜法同時測定食品中的甲基香蘭素和乙基香蘭素[J].中華預防醫(yī)學雜志，2006，40（4）：296-297.

[4] 羅冠中，劉祥，孟云彩.液相色譜串聯(lián)四極桿質譜法同時測定嬰幼兒配方食品中甲基香蘭素和乙基香蘭素[J].分析試驗室，2011，30（8）：84-87.

[5] 曲寶成，戴學東，張敬波，等.高效液相色譜串聯(lián)質譜法測定植物油中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素[J].食品安全質量檢測學報，2018，9（4）：935-941.

[6] 周靜，彭亞鋒，胡守江.同位素稀釋-氣相色譜-質譜法同時測定嬰兒配方乳粉中的4種香料[J].食品安全質量檢測學報，2018，9（14）：3643-3649.

[7] 趙建國，姜金斗.氣相色譜質譜聯(lián)用測定嬰幼兒奶粉中香蘭素和乙基香蘭素[J].生命科學儀器，2013，11（5）：40-44.

[8] 蘇建峰，林谷園，連文浩，等.兩種水產品中農藥多殘留分析的樣品前處理方法及其在111種農藥和相關化學品殘留同時檢測中的應用[J].色譜，2008，26（3）：292-300.

[9] 李曉婷，王紀華，朱大洲，等.果蔬農藥殘留快速檢測方法研究進展[J].農業(yè)工程學報，2011，27（S2）：363-370.

[10] 黎其萬，劉宏程.測定植物油中甲萘威和克百威農藥殘留的高效液相色譜法[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（8）：91-92.

[11] 程景，李培武，張文，等.基質固相分散-氣相色譜法測定植物油中多種擬除蟲菊酯類及有機磷類農藥殘留[J].中國油料作物學報，2008，30（3）：346-352.

[12] 賈瑋，凌云，郝靜，等.在線凝膠滲透色譜串聯(lián)氣相色譜-質譜快速測定糧谷及油料作物中29種農藥殘留[J].分析測試學報，2012，31（10）：1217-1222.

[13] 徐娟，王嵐，黃華軍，等.低溫冷凍及分散固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定植物油中104種農藥殘留[J].色譜，2015，33（3）：242-249.