馬登磊 張 旭 張 麗 李雅莉 張 蘭 李 林*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部 神經(jīng)變性病教育部重點實驗室 北京市神經(jīng)藥物工程研究中心，北京 100053； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實驗室，北京 100053)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)為外力對大腦的損害，已經(jīng)成為影響人類生命健康的重要原因之一，為社會帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[1]。認(rèn)知障礙是創(chuàng)傷性腦損傷(包括腦震蕩和輕度腦外傷等)的常見后遺癥之一，近15%輕度腦外傷患者和65%中重度腦外傷患者出現(xiàn)了認(rèn)知損傷相關(guān)的后遺癥[2]。此外，創(chuàng)傷性腦損傷是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的危險因素之一[3]。研究[4-5]顯示，創(chuàng)傷性腦損傷患者腦內(nèi)也會出現(xiàn)與AD患者相同的病理表現(xiàn)，如tau蛋白過度磷酸化、Aβ沉積、神經(jīng)元丟失和突觸丟失等。其中tau蛋白過度磷酸化產(chǎn)生病理性tau蛋白是引起神經(jīng)元變性及認(rèn)知功能障礙的重要原因之一[6]。

傳統(tǒng)中藥山茱萸具有補(bǔ)益肝腎的作用,山茱萸環(huán)烯醚萜苷(cornus iridoid glycosides, CIG)是首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室自行從山茱萸中提取的有效成分。研究[7-8]顯示，CIG能夠改善TBI模型大鼠急性期(造模后24～72 h)的神經(jīng)功能損傷，降低血清和腦內(nèi)TBI生物學(xué)標(biāo)志物S100β蛋白的含量，減輕神經(jīng)炎性反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，增加神經(jīng)元存活數(shù)量。CIG能夠改善創(chuàng)傷性脊髓損傷大鼠的運(yùn)動功能障礙，減小脊髓損傷灰質(zhì)和白質(zhì)的體積，促進(jìn)軸突生長[9]。本研究采用自由落體致創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型，在造模后28 d觀察CIG對該模型認(rèn)知功能的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，包括CIG對變性神經(jīng)元和tau蛋白過度磷酸化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠80只，雄性，體質(zhì)量230～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2007-0001。實驗動物飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實驗動物室屏障系統(tǒng)中，自由進(jìn)食進(jìn)水，保持每日12 h/12 h光照周期控制，溫度控制20～25 ℃。所有飼養(yǎng)條件及操作規(guī)范按照首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實驗動物倫理委員會的要求進(jìn)行。

1.2 主要藥品、試劑及儀器

CIG：由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室自行研制，從山茱萸中提取和分離獲得CIG，純度為70% (其中主要成分為莫諾苷和馬錢苷)。實驗中采用干粉劑量，溶解于蒸餾水，制成藥液應(yīng)用。陽性藥為單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷酯鈉注射液(monosialotetrahexosyl-ganglioside sodium injection，GM1)：齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20046213；適應(yīng)證為血管性或外傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，帕金森病。

pT205抗體(識別tau蛋白蘇氨酸205位點磷酸化，貨號44-838G)、pS396抗體(識別tau蛋白絲氨酸396位點磷酸化，貨號44-752G),購自美國Thermo Fisher Scientific公司。Tau5抗體(識別總tau，貨號577801),購自美國Calbiochem公司;Fluoro Jade B染料，購自美國Sigma-Aldrich公司。

AH-AYQ腦創(chuàng)傷打擊器,安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司。BA-1大鼠避暗實驗箱,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。Western blotting法電泳及電轉(zhuǎn)設(shè)備,美國Bio-Rad公司?；瘜W(xué)凝膠成像系統(tǒng),美國Protein Simple 公司。

1.3 TBI大鼠模型制備

參考Feeney等[10]所述方法，應(yīng)用腦創(chuàng)傷打擊器，制備自由落體打擊致腦損傷模型。麻醉后大鼠俯臥于打擊器上，頭顱固定后，備皮并暴露右側(cè)顱骨。在前囟下2 mm，顱骨中線右2.5 mm，用牙科鉆鉆直徑5 mm 的圓形骨窗，保持硬腦膜完好無損。之后將打擊墊置于暴露的硬腦膜上，采用腦打擊裝置，以25 g砝碼從40 cm高處自由下落撞擊于右頂骨窗之硬膜上，造成右頂腦挫裂傷，下陷深度約2.5 mm，致傷力1 000 g/cm。止血完全后，縫合頭皮。假手術(shù)組除不打擊造成腦挫傷外，其余步驟同前。手術(shù)后，大鼠置于恒溫加熱毯中直至麻醉蘇醒。撞擊后，大鼠出現(xiàn)短暫呼吸抑制，表明致傷成功。若手術(shù)過程中硬腦膜開放者、失血過多、術(shù)后3 h內(nèi)死亡者，作為造模失敗，不計入實驗組。

1.4 動物分組及給藥

造模成功大鼠蘇醒后采用數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、CIG小劑量(30 mg/kg)組、CIG中劑量(60 mg/kg)組、CIG大劑量(120 mg/kg)組、陽性藥 (GM1，14 mg/kg)組；假手術(shù)大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組、對照+CIG中劑量 (60 mg/kg)組；每組大鼠8～13 只。各組在造模后3 h 進(jìn)行第1次給藥，之后每天給藥1次，共計28 d。CIG溶于0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液中，灌胃口服給藥。陽性藥神經(jīng)節(jié)苷脂GM1為肌肉注射給藥。

1.5 避暗實驗

避暗實驗是利用嚙齒類動物趨暗的特性而設(shè)計的檢測被動回避記憶能力的行為學(xué)方法[11]。實驗裝置分為明暗兩室，明室有燈照射，暗室底部有通電銅柵，兩室間有小門連接。訓(xùn)練時將動物放置在明室，因其嗜暗的特性鉆入暗室，此時動物接受電擊獲得記憶。記錄大鼠在第2次訓(xùn)練24 h后首次進(jìn)入暗室的時間(步入潛伏期)，以及進(jìn)入暗室的次數(shù)(錯誤次數(shù))。

1.6 Fluoro Jade B染色

將大鼠麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺上，開胸暴露心臟。由主動脈弓進(jìn)針，在右心耳處剪開一小口，先后灌入0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液和4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛，四肢僵硬即固定完成，分離取出腦組織。將取出的腦組織浸于含4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛和30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖的后固定液中脫水。固定好的腦組織進(jìn)行冰凍切片，得到厚度為20 μm的腦片。之后用特異性標(biāo)記變性神經(jīng)元的熒光染料Fluoro Jade B，參照文獻(xiàn)[12]中方法進(jìn)行Fluoro Jade B染色。每只大鼠隨機(jī)選取3張腦片，貼于預(yù)先明膠處理過的載玻片上。待自然晾干。按照以下步驟染色：①貼片浸入含1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaOH的80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液中5 min；②貼片入70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液中20 min，之后蒸餾水中浸洗2 min；③貼片入0.06%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))高錳酸鉀溶液中10 min，蒸餾水沖洗2 min；④貼片于0.000 4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Fluoro Jade B染色液[溶于0.1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸]中染色20 min，之后蒸餾水沖洗3 min；⑤貼片在50 ℃條件下烘干，用DAPI封片劑封片后，在熒光顯微鏡下觀察及拍照。

圖1 CIG對TBI模型大鼠在避暗試驗中表現(xiàn)的影響

1.7 Western blotting法檢測

每組采用數(shù)字表法隨機(jī)選3只大鼠，麻醉后取出腦組織，在0 ℃，0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液中剝離出損傷區(qū)域腦組織，置于組織凍存管中。液氮速凍后放入-80 ℃保存。之后將得到的腦組織按照1 mg∶10 mL比例加入的組織勻漿液(加入苯甲基磺酰氟、蛋白酶抑制劑等)，裂解后加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃加熱變性蛋白。用RC-DC法對蛋白含量進(jìn)行測定。取30～50 μg樣品，10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS-PAGE凝膠電泳及電轉(zhuǎn)，蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))TBST脫脂奶粉封閉，加入一抗(1∶1 000)4 ℃過夜。第2天洗去一抗后，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠或抗兔IgG抗體(1∶2 000) 孵育，室溫2 h。加發(fā)光液后，在化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中得到蛋白條帶。用TINA軟件對目的條帶進(jìn)行灰度分析和統(tǒng)計，與β-actin灰度比值后得到蛋白相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CIG對TBI大鼠記憶功能的影響

在TBI術(shù)后28 d進(jìn)行避暗試驗，記錄大鼠在第2次訓(xùn)練24 h后首次進(jìn)入暗室的時間(步入潛伏期)以及進(jìn)入暗室的次數(shù)(錯誤次數(shù))。步入潛伏期在各組小鼠間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A)；模型組大鼠進(jìn)入暗室的錯誤次數(shù)與假手術(shù)組相比顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而灌胃給予CIG(30、60、120 mg/kg)28 d能夠降低TBI大鼠的錯誤次數(shù)，其中CIG中劑量與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。

圖2 CIG對TBI大鼠海馬區(qū)變性神經(jīng)元的影響

2.2 CIG對TBI大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元變性的影響

FJB染色結(jié)果顯示，假手術(shù)大鼠海馬區(qū)沒有陽性著色(圖2)。TBI模型組大鼠海馬區(qū)出現(xiàn)較多的綠色熒光陽性細(xì)胞，變性神經(jīng)元增多；CIG中劑量和大劑量組的陽性細(xì)胞數(shù)量與TBI模型組相比明顯減少。

2.3 CIG對TBI大鼠創(chuàng)傷部位tau蛋白磷酸化的影響

應(yīng)用Western blotting法檢測TBI大鼠創(chuàng)傷部位磷酸化tau蛋白的表達(dá)。與假手術(shù)組比較，TBI模型組大鼠創(chuàng)傷部位tau蛋白在蘇氨酸(Thr)205位點和絲氨酸(Ser)396位點的磷酸化水平顯著增高(P<0.05)；而給予CIG能夠降低TBI大鼠tau蛋白Thr205位點的磷酸化水平，其中CIG中、大劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；給予CIG也能夠降低tau蛋白Ser396位點的磷酸化水平，其中CIG大劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組小鼠的總tau蛋白含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),詳見圖3。

圖3 CIG對TBI大鼠創(chuàng)傷部位tau蛋白磷酸化水平的影響

3 討論

本研究中應(yīng)用TBI大鼠模型模擬腦外傷引起的認(rèn)知障礙。研究[13]顯示，大部分中到重度的TBI模型在術(shù)后4～8周有較明顯的認(rèn)知障礙行為學(xué)表現(xiàn)。本研究的行為學(xué)結(jié)果顯示，在造模28 d后TBI模型組大鼠在避暗試驗中的錯誤次數(shù)顯著增加，而CIG治療能夠減少模型大鼠的錯誤次數(shù)，提示CIG可以改善TBI大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

在TBI損傷中，最初的神經(jīng)元損傷主要來源于外力打擊引起的組織損傷，而繼發(fā)性的神經(jīng)元損傷主要是由TBI后持續(xù)數(shù)天或數(shù)月的級聯(lián)反應(yīng)引起，如氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等[14-15]。TBI直接打擊造成大量神經(jīng)元的壞死，以及繼發(fā)引起損傷區(qū)域的細(xì)胞壞死、凋亡、變性，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的丟失[16]。為了進(jìn)一步研究CIG改善TBI認(rèn)知障礙的機(jī)制，本研究進(jìn)行了病理學(xué)染色。Fluoro Jade B是一種特異性標(biāo)記變性神經(jīng)元的熒光染料[12]。本研究Fluoro Jade B染色結(jié)果顯示，TBI模型大鼠在損傷灶周圍的變性神經(jīng)元明顯增多，提示在損傷恢復(fù)期仍舊存在神經(jīng)元的退行性病變。而CIG治療能夠減輕TBI大鼠損傷灶周圍神經(jīng)元的退行性病變。結(jié)合之前的結(jié)果，筆者推測CIG可能通過減低神經(jīng)元的退行性病變和死亡，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，這可能是CIG改善TBI大鼠認(rèn)知功能的機(jī)制之一。

Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，正常情況下tau蛋白在細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)微管的組裝，抑制微管的解聚，維持微管的運(yùn)輸功能。但是，當(dāng)tau蛋白過度磷酸化并發(fā)生病理性聚集時，微管的正常組裝受到破壞，進(jìn)而損傷軸突的運(yùn)輸和神經(jīng)元的功能[17-19]。創(chuàng)傷性腦損傷后tau蛋白會出現(xiàn)過度磷酸化，并且tau蛋白的磷酸化對于疾病的進(jìn)展及認(rèn)知障礙有促進(jìn)作用[20-21]。而TBI作為AD的一個重要的危險因素，tau蛋白的磷酸化與其他多種病理改變均可以促進(jìn)神經(jīng)退行性病變的進(jìn)展[3,22]。TBI后引起的tau蛋白磷酸化水平增高及其病理性聚集，會加重認(rèn)知障礙等疾病表現(xiàn)，磷酸化tau蛋白清除后可以改善疾病的愈后以及認(rèn)知表現(xiàn)[6,23]。在本研究中，模型組大鼠創(chuàng)傷部位的tau蛋白在Thr205位點及Ser396位點的磷酸化水平顯著增加，而給予CIG治療能夠明顯降低TBI大鼠tau蛋白的過度磷酸化。這可能是CIG減輕TBI大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元變性和死亡的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究中CIG可以通過降低tau蛋白的過度磷酸化，進(jìn)而減輕神經(jīng)元變性，最終改善TBI大鼠的認(rèn)知功能。CIG可能有利于治療腦外傷引起的認(rèn)知障礙。