（紹興市柯橋區(qū)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，浙江 紹興 312030）

1 引言

鐵載體是微生物和部分植物分泌到胞外進(jìn)行結(jié)合并獲取鐵的小分子，其能與高親和力鐵結(jié)合。依據(jù)其與鐵結(jié)合的基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)，鐵載體主要分為氧肟酸鹽類、兒茶酚類以及羧酸鹽類三類。

隨著新的鐵載體結(jié)構(gòu)被不斷解析出來，人們發(fā)現(xiàn)有些鐵載體包含兩種以上螯合鐵的基團(tuán)，屬于“混合型”的鐵載體。氧肟酸鹽類鐵載體是自然界中最常見的，氧肟酸基團(tuán)中的兩個氧原子與鐵原子形成二齒配體，因此每個此類鐵載體都能與Fe3+形成八面體的六齒配體。氧肟酸鹽類鐵載體與Fe3+的結(jié)合常數(shù)在1 022～1 032M-1之間，這種強(qiáng)結(jié)合能力保證其與鐵的復(fù)合物不會輕易被水解。奧奈達(dá)希瓦氏菌屬于革蘭氏陰性γ-變形菌門，其可在海水、淡水或一些沉積物中發(fā)現(xiàn)，是一種兼性厭氧菌，擁有超過40 多種細(xì)胞色素c，這使得其本身的顏色呈現(xiàn)特征性粉紅色，并且使其能夠呼吸多種電子受體，包括氧氣、甘氨酸、硝酸鹽、亞硝酸、鹽、硫、延胡索酸鹽、二甲基亞砜。這些特征使奧奈達(dá)希瓦氏菌在生物環(huán)境修復(fù)和燃料電池等方向備受青睞，是一種重要的環(huán)境模式生物。

本文主要研究了ΔputA 在液體LB 中的菌體，顏色為白色，并且其對鐵螯合劑2，2′-聯(lián)吡啶比MR-1 更為敏感，這說明PutA 是鐵吸收的一個關(guān)鍵蛋白。而通過測量胞內(nèi)heme 發(fā)現(xiàn)，ΔputA-WC 菌株中heme 含量比MR-1 中低，即ΔputA 的白色表型是由其胞內(nèi)heme 缺乏引起的。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

所用試劑除非特別說明外，均購于sigma（shanghai，China）公司。基因水平方面的操作，E.coli 和S.oneidensis在有氧條件下培養(yǎng)時，采用Lysogeny Broth（LB，Difco，MI，USA）液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L），或者添加了1.5%（W/V）瓊脂的LB 固體培養(yǎng)基。液體LB 如無特殊說明均為過濾滅菌，經(jīng)孔徑為0.22 μm的濾膜過濾。培養(yǎng)溫度分別為37 ℃和30 ℃。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，培養(yǎng)基中添加的化學(xué)物質(zhì)和濃度為2，6-二氨基庚二酸（DAP）0.3 mM，氨芐青霉素50 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL，慶大霉素50 μg/mL。

3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 heme stain 染色

heme stain 用于細(xì)菌胞內(nèi)細(xì)胞色素c 的染色，具體流程：取2 mL OD600=1.0 的菌液，用PBS 緩沖液沖洗2 遍，隨后以12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心1 min。接著用500 μL PBS 溶液重懸后，取40 μL 樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳實(shí)驗(yàn)。此電泳要在4 ℃下進(jìn)行，并且需要遮光。電泳結(jié)束后，使用TMBZ 染液進(jìn)行染色1.5 h（染色過程也要避光）后，加雙氧水（終濃度30 mM）進(jìn)行顯色。TMBZ 染液由兩部分溶液混合而成，0.2%TMBZ 溶液（溶劑是甲醇）和0.25 mol/L 乙酸鈉。兩種溶液在染色前混合即可，不可提前太久。

3.2 胞內(nèi)heme 含量的測定

測量S.oneidensis 胞內(nèi)heme 含量時，采用文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行。此方法原理是，heme 含有鐵元素，當(dāng)加入大量還原劑后，其中的鐵會還原成二價鐵，還原態(tài)heme 與吡啶可以形成吸光系數(shù)很高的復(fù)合物，通過測定特定波長的吸光度可以檢測heme 的含量。此方法共使用了三種溶液，溶液I包含40%（V/V）吡啶、0.2 M NaOH 和500 μM 鐵氰化鉀K3[Fe（CN）6]。吡啶用來結(jié)合還原態(tài)heme，NaOH 可以給連二亞硫酸鈉提供堿性環(huán)境，鐵氰化鉀能先將所有heme 變成氧化態(tài)。溶液II 是0.1 M 鐵氰化鉀，而溶液III 是0.5 M連二亞硫酸鈉（溶劑：0.5 M NaOH）。樣品中heme 的含量可通過還原態(tài)heme 與吡啶的復(fù)合物的吸光度來確定。

3.3 胞內(nèi)總鐵含量測定

本研究測量胞內(nèi)總鐵采用的是菲洛嗪（Ferrozine）顯色法。菲洛嗪能與二價鐵離子結(jié)合成一種復(fù)合物，該復(fù)合物在550 nm 波長處有吸收峰。由于菲洛嗪不與三價鐵離子結(jié)合，所以需要用抗壞血酸將樣品中所有鐵還原成二價。鐵被吸收至細(xì)菌胞內(nèi)后，會被儲鐵蛋白結(jié)合成復(fù)合物，在測量之前，需要用鐵釋放劑（iron-releasing regent）將鐵游離出來。鐵釋放劑配方：新鮮配制的1.4 M 鹽酸和4.5%（W/V）KMnO4等體積混合。之后再用鐵檢測試劑（iron-detection reagent）進(jìn)行測量。鐵檢測試劑配方：6.5 mM 菲洛嗪、6.5 mM 新亞銅試劑（neocuproine）、2.5 M 醋酸銨、1 M 抗壞血酸。菌樣離心收集后，用預(yù)冷的PBS 洗2 遍，再用50 mM NaOH 懸浮后超聲破碎。100 μL 細(xì)胞裂解液與100 μL 10 mM 鹽酸混合后，加入100 μL 鐵釋放劑，60 ℃恒溫置于通風(fēng)櫥中2 h。冷卻至室溫后，加入30 μL 鐵檢測試劑，30 min 后取出280 μL加入96 孔板中，測量其在550 nm 波長下的吸光度。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由于PutA 與S.oneidensis 鐵載體吸收的密切關(guān)系，猜想ΔputA 在缺鐵的環(huán)境中不能有效轉(zhuǎn)運(yùn)鐵，因此其生長會受到影響。所以在LB 中添加不同濃度的鐵螯合劑2，2′-聯(lián)吡啶來觀察ΔputA 的生長情況。結(jié)果如圖1 所示，在LB 中不存在聯(lián)吡啶情況下，ΔputA 的生長和MR-1 相差很小。這是由于LB 中鐵元素和其他營養(yǎng)成分含量豐富，細(xì)菌不需要分泌鐵載體就已經(jīng)能夠獲得維持自身生長所需鐵原子。而在LB 中添加50 μM 的2，2′-聯(lián)吡啶，ΔputA 就已經(jīng)表現(xiàn)出了明顯的生長缺陷，而此時野生型生長基本不受影響。當(dāng)LB中的2，2′-聯(lián)吡啶達(dá)到150 μM 時，ΔputA 已完全不能生長。此實(shí)驗(yàn)說明，在缺鐵環(huán)境中，PutA 的功能對S.oneidensis 的生長是十分重要的。

圖1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)S.oneidensis 處于鐵匱乏的環(huán)境中時，其對鐵的需求主要依靠分泌鐵載體進(jìn)行螯合鐵，再將鐵-鐵載體吸收至胞內(nèi)消化。PutA 作為S.oneidensis 分泌的鐵載體、putrebactin的受體，當(dāng)LB 中添加鐵螯合劑2，2′-聯(lián)吡啶使之缺鐵時，ΔputA 不能將胞外的鐵-鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，使其生長出現(xiàn)缺陷。

5 結(jié)語

PutA 作為S.oneidensis 合成的鐵載體、putrebactin 的受體，其敲除突變株在LB 中呈現(xiàn)白色性狀。在LB 中添加2，2′-聯(lián)吡啶使其鐵處于缺乏狀態(tài)時，ΔputA 相比于野生型表現(xiàn)出了明顯的生長缺陷。這是由于S.oneidensis 吸收環(huán)境中的三價鐵主要靠分泌出的鐵載體，后者螯合鐵被PutA 吸收進(jìn)胞內(nèi)。putA 基因的破壞會導(dǎo)致S.oneidensis 吸收鐵的途徑受到破壞，從而使ΔputA 在LB 中生長時難以獲取足量的鐵而呈現(xiàn)白色菌體表型。因此，奧奈達(dá)希瓦氏菌在生物環(huán)境修復(fù)中應(yīng)用前景非常廣泛。