原曉龍，王 毅，張勁峰

(1.云南省林業(yè)和草原科學院，云南 昆明 650201；2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室，云南 昆明 650201)

葉綠體擁有一套獨立于核的基因組，是一種存在于植物中的半自主性細胞器，屬細胞質(zhì)遺傳[1]。葉綠體是植物光合作用的細胞器，且植物的能量供給和次生代謝產(chǎn)物的生物合成均在其參與下完成[2]。植物花粉中不含葉綠體，且葉綠體基因拷貝數(shù)多、基因組數(shù)量多[3]，因此以葉綠體基因組為受體進行轉(zhuǎn)基因操作可避免花粉逃逸帶來的生物安全問題[4]，并可迅速得到表達量較高的轉(zhuǎn)基因后代[1]，葉綠體基因工程已在擬南芥[Arabidopsisthaliana(L.) Heynh][5]、棉花(GossypiumhirsutumL.)[6]等植物中成功轉(zhuǎn)化。葉綠體基因工程是以基因序列的同源重組為基礎[7]，因此通過研究葉綠體基因組的蛋白編碼序列特征和密碼子的堿基組成，有助于提高遺傳轉(zhuǎn)化效率和目的基因高效穩(wěn)定表達[8]，還可以評估分子系統(tǒng)進化水平[9]。蛋白編碼序列的DNA由除起始密碼子和終止密碼子外通用的61個密碼子翻譯，除蛋氨酸和色氨酸外，其余氨基酸均有兩種以上的同義密碼子共同編碼[10]；各同義密碼子在翻譯過程中的使用頻率并不均等，這種現(xiàn)象稱為密碼子偏好性(codon usage bias, CUB)[11]。密碼子偏好性在不同物種、組織或基因中具豐富的多樣性，這是物種或基因在長期的進化過程中受自然選擇、堿基突變及遺傳漂移等因素綜合作用的結(jié)果[12-13]；同時密碼子偏好性還與基因組大小[14]、內(nèi)含子數(shù)量[15]、tRNA豐度[16]和基因表達水平[17]等因素存在關聯(lián)。密碼子偏好性是物種的進化特征之一，分析密碼子的使用模式和影響因素，有助于對生物適應性的分子機制、物種間的進化關系等研究提供參考依據(jù)。

灰毛漿果楝[Cipadessacinerascens(Pell.) Hand.-Mazz.]又名亞洛輕、假茶辣等，為楝科(Meliaceae)漿果楝屬(Cipadessa)植物，灌木或小喬木，主要生長在四川、貴州、廣西及云南等地160～2400m的雨林、常綠闊葉林、山坡灌叢和草地[18-19]?；颐珴{果楝的根、葉及全株均可入藥，目前已報道的主要成分包括二萜、黃酮及其苷，以及作為楝科植物特征次生代謝產(chǎn)物的檸檬苦素等化合物，其中檸檬苦素類化合物含有豐富的四降三萜的結(jié)構(gòu)骨架，含四降三萜結(jié)構(gòu)骨架的化合物具抗腫瘤、抗菌、拒食活性等生物活性[18,20-21]。目前多種植物的葉綠體基因組全長序列已經(jīng)測定完成，葉綠體基因密碼子使用模式在竹亞科植物[10]和7種作物[1]中已有報道。本研究通過對灰毛漿果楝葉綠體基因組進行高通量測序，通過同源序列比對和基因注釋獲得了蛋白編碼序列，以此為基礎，對灰毛漿果楝葉綠體基因的密碼子使用模式進行初步分析，探討影響其密碼子使用偏性形成的主要因素,以期為灰毛漿果楝葉綠體分子進化、明確灰毛漿果楝的系統(tǒng)發(fā)育位置、不同種源鑒定及葉綠體基因工程等提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

灰毛漿果楝葉片采自云南省林業(yè)和草原科學院普文熱帶林業(yè)研究所，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，獲得灰毛漿果楝葉綠體基因組數(shù)據(jù)并提交至美國國立生物技術(shù)中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)查詢其登錄號為MN126582，對其葉綠體的編碼序列(coding sequence, CDS)進行篩選，剔除序列長度小于300bp、序列不完整和序列中間存在終止密碼子的序列，留存含有起始密碼子ATG和末端終止密碼子UAA、UAG、UGA的CDS[22]。從灰毛漿果楝葉綠體基因組85條蛋白編碼序列中篩選得到54條CDS。

1.2 研究方法

對從灰毛漿果楝葉綠體基因組中篩選得到的54條CDS進行分析，其中通過在線軟件CUSP(http:∥emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp)計算不同基因密碼子各位置的鳥嘌呤和胞嘧啶(guanine and cytosine, GC)含量(GC1、GC2、GC3)[1]，以GC12(GC1、GC2的平均值)為縱坐標、以GC3為橫坐標進行中性繪圖分析，以GC3為橫坐標、有效密碼子數(shù)(effective number of codons,Nec)為縱坐標進行有效密碼子數(shù)繪圖(Nec-plot)分析，以A3/(A3+T3)為縱坐標、G3/(G3+C3)為橫坐標進行奇偶偏差(PR2-plot)分析，通過上述分析以明確灰毛漿果楝葉綠體基因組密碼子的使用偏性規(guī)律[1,10]。

結(jié)合灰毛漿果楝葉綠體基因組密碼子的高頻率密碼子和高表達密碼子的分析結(jié)果，將同義密碼子相對使用度(relative synonymous codon usage,URSC)>1的密碼子確定為高頻密碼子；以Nec值為偏好性標準，選擇兩極10%的基因構(gòu)建高低偏性基因庫，將ΔURSC≥0.08的密碼子定為高表達優(yōu)越密碼子；最終將同時滿足2種條件的密碼子定為灰毛漿果楝葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體編碼基因同義密碼子的使用偏性

選擇灰毛漿果楝葉綠體基因組中CDS長度大于300bp的54個蛋白編碼序列整合成一個整體進行同義密碼子偏好性分析，該序列共有64473bp的核苷酸序列，21491個有義密碼子，其中含21437個同義密碼子。用Codon W1.4.2和在線軟件CUSP分析該序列，得到灰毛漿果楝葉綠體基因組不同位置的GC含量(表1)，在灰毛漿果楝葉綠體基因組中，密碼子的平均GC含量為38.70%，3個位置上GC含量從大到小依次為GC1、GC2、GC3，含量分別為47.41%、39.74%和28.95%，可見葉綠體基因中的GC含量總體較低，且3個位置上GC含量差異較大，表現(xiàn)為GC3含量最低，說明在灰毛漿果楝葉綠體中，以A和T堿基結(jié)尾的密碼子的使用頻率高于以G和C堿基結(jié)尾的密碼子。Nec作為判斷密碼子使用偏性的指標之一，取值范圍從20到61，具體可闡釋為若每個氨基酸僅用一個密碼子則Nec值為20，若各同義密碼子的使用機會完全均等則Nec值為61，即Nec值越小則密碼子使用偏性則越大[24]；灰毛漿果楝葉綠體基因組的Nec平均值為48.09，Nec實際值介于34.60～61.00，Nec值大于45的基因有39個，說明該葉綠體基因組的密碼子使用偏性非隨機選擇，且偏性較弱。

GC1、GC2、GC3、GCall、Nec和密碼子數(shù)目(N)的相關性分析結(jié)果(表2)表明，GCall與GC1、GC2、GC3，GC1與GC2等均呈極顯著相關，GC3與GC1、GC2均未達到顯著相關，說明密碼子的第1位和第2位堿基組成相似，而與密碼子第3位堿基組成存在差異。Nec與GC3呈極顯著相關，Nec與GC2呈顯著相關，Nec與GC1未達到顯著相關水平，說明密碼子第2位和第3位堿基GC含量對密碼子偏好性有影響，其中第3位影響最大。GC3和N呈顯著相關關系，說明N對Nec具一定的影響。除蛋氨酸和色氨酸外，其余18種氨基酸的URSC值(表3)顯示，URSC值大于1的密碼子有29個，其中16個以U結(jié)尾，12個以A結(jié)尾，1個以G結(jié)尾，密碼子以A和U出現(xiàn)的頻率較高，說明其為灰毛漿果楝葉綠體基因組的偏好密碼子，而以C和G結(jié)尾的密碼子為非偏好密碼子。

注：**表示在P<0.01水平(雙側(cè))上顯著相關；*表示在P<0.05水平(雙側(cè))上顯著相關。Notes:**means extremely significant correlation atP<0.01(bilateral);*means significant correlation atP<0.05(bilateral).

表3 灰毛漿果楝各氨基酸相對同義密碼子使用度Table 3 URSC analysis of protein coding region in C. cinerascens

2.2 葉綠體基因組密碼子使用的中性繪圖分析

灰毛漿果楝葉綠體基因組中各基因中性繪圖分析(圖1)顯示，GC12處于0.331 7～0.575 6區(qū)間，GC3處于0.200 0～0.369 5區(qū)間；除ycf2基因的GC12(0.384 4)、GC3(0.369 5)，二者的比值為1.04，在圖中接近對角線；其余基因均分布在對角線上方。采用SPSS 19.0軟件分析GC12和GC3的相關性統(tǒng)計(Pearson)的相關系數(shù)為0.098 4，相關性不顯著，回歸系數(shù)(對角線斜率)為0.137 9，表明在灰毛漿果楝葉綠體基因組中，各基因的密碼子第1位、第2位與第3位的堿基組成無顯著差異，其密碼子使用偏性較多地受選擇壓力的影響。

2.3 葉綠體基因組有效密碼子數(shù)繪圖分析

GC3與Nec的關聯(lián)分析(圖2)顯示，灰毛漿果楝葉綠體中的部分基因位于標準曲線附近，這部分基因的實際Nec值與預期Nec值接近；另一部分基因距離標準曲線較遠的位置，即實際Nec值與預期Nec值差異較大。為了更準確地說明哪些基因離標準曲線較近，采用Nec比值((預期Nec值-實際Nec值)/預期Nec值)統(tǒng)計Nec比值頻數(shù)(表4)，結(jié)果顯示Nec比值位于-0.05～0.05區(qū)間外的基因數(shù)有36個，即大部分基因的實際Nec值與預期Nec值的相差較大，密碼子偏好性與GC3的差異有關，故灰毛漿果楝葉綠體基因組密碼子偏好性更多地受選擇的影響。

圖1 密碼子使用的中性繪圖分析 圖2 密碼子使用的有效密碼子數(shù)繪圖分析

Figure 1 Neutrality plot analysis of the codon usage Figure 2Nec-plot analysis of the codon usage

表4 有效密碼子數(shù)比值頻數(shù)分布Table 4 Distribution of Nec ratio of the codon usage

2.4 葉綠體基因組密碼子的奇偶偏差繪圖分析

通過PR2-plot繪圖分析灰毛漿果楝各基因編碼的部分氨基酸的嘌呤(A和G)與嘧啶(T和C)的關系(圖3)，結(jié)果顯示，大部分基因位于PR2平面圖的下方，其中位于PR2平面圖右下方的基因較多，說明在堿基使用頻率方面，T>A且G>C；如果僅受堿基突變的影響，則4個堿基平均分布在PR2平面，這個結(jié)果說明灰毛漿果楝葉綠體基因組密碼子使用模式受多種因素共同作用的影響。

2.5 葉綠體基因組中最優(yōu)密碼子的確定

將灰毛漿果楝葉綠體基因組中的54個編碼基因作為一個整體在Codon W 1.4.2軟件上運行，以Nec值為標準進行排序，選擇兩極5%的構(gòu)建高表達

圖3 奇偶偏差繪圖分析

和低表達基因庫，分別對兩個庫中的密碼子計算URSC值，再統(tǒng)計各基因ΔURSC值(表5)，篩選得到0.08≤ΔURSC<0.30的密碼子，含UUC、UUG和CUA等26個高表達優(yōu)越密碼子(在表5中用*表示)，其中6個以A結(jié)尾、9個以U結(jié)尾、2個以G結(jié)尾和9個以C結(jié)尾；0.30≤ΔURSC<0.50的有9個，ΔURSC≥0.50的有5個。結(jié)合高頻密碼子和高表達優(yōu)越密碼子，將同時滿足2種條件的密碼子確定為灰毛漿果楝葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子，即可最終確定GUU、GUA、UCU、AGU、CCU、ACU、GGU、GCU、CAA、AAA、UGU、AGA和AUU，且全部以A或U結(jié)尾，其中9個以U結(jié)尾，4個以A結(jié)尾。

表5 灰毛漿果楝葉綠體基因組最優(yōu)密碼子確定Table 5 Preferred codons in chloroplast genome of C. cinerascens

注:*表示0.08≤ΔURSC<0.30,**表示0.30≤ΔURSC<0.50,***表示ΔURSC≥0.50。Notes:*means 0.08≤ΔURSC<0.30,**means 0.30≤ΔURSC<0.50,***means ΔURSC≥0.50.

3 討論與結(jié)論

遺傳密碼子是關聯(lián)基因組DNA和功能蛋白質(zhì)的聯(lián)系樞紐，是構(gòu)成生命信息的基本單元。然而除了蛋氨酸和色氨酸外，其余氨基酸的同義密碼子的使用頻率并不相同，而是存在一定的使用偏性[17]；同義密碼子的主要區(qū)別在于密碼子的第3位堿基，密碼子第3位堿基的改變通常不會引起編碼氨基酸的改變，所受選擇壓力較小，因此研究密碼子第3位堿基組成對研究植物葉綠體密碼子使用偏好性具重要意義[23]。本研究通過中性繪圖分析及比較灰毛漿果楝葉綠體基因組密碼子3位堿基上的GC含量發(fā)現(xiàn)，密碼子第3位堿基大多數(shù)為A和T；與大多數(shù)植物的葉綠體基因組密碼子偏好性基本一致[1,10,23-24]。密碼子使用偏性的主要驅(qū)動力是自然選擇和堿基突變[12]，Nec與GC3的相關性分析結(jié)合Nec比值頻數(shù)分布能夠推斷密碼子使用偏性的主要影響因素，即通過比較基因與標準曲線的距離遠近的數(shù)量，若距標準曲線距離近的基因數(shù)量較多，則主要受突變的影響；而距標準曲線距離較遠的基因數(shù)量較少，則主要受選擇的影響[25]；同時Nec值以45為界限，小于45則偏性較強，相反則偏性較弱[1]。本研究中灰毛漿果楝葉綠體基因組中的密碼子偏好性較弱，且36個基因與標準曲線的距離較遠，即大多數(shù)基因與標準曲線距離較近，說明其密碼子偏好性主要受選擇的影響；該植物葉綠體基因組密碼子的使用偏性與蒺藜苜蓿(MedicagotruncatulaL.)[23]、刺五加[Eleutherococcussenticosus(Rupr. and Maxim) Maxim][25]、黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)[26]、酸棗[ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chou][27]等植物一致。同時PR2-plot分析亦證明灰毛漿果楝葉綠體基因組中的密碼子偏好性受突變及其他因素的影響，說明影響植物密碼子偏好性的因素均非單一因素，而是多因素綜合的結(jié)果。

密碼子偏好性說明某些蛋白質(zhì)編碼基因序列內(nèi)存在較少使用的稀有密碼子，與其匹配的同義tRNA數(shù)量同樣較少，會導致翻譯速率降低，生物合成酶產(chǎn)出量亦會減少，因此對目標基因的密碼子進行優(yōu)化，可有效提高其蛋白的產(chǎn)出量[11,12,17]。最優(yōu)密碼子的確定需滿足高頻率和高表達密碼子兩個標準[24]，本研究中灰毛漿果楝葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子均以A或U結(jié)尾。之所以要采用高頻率和高表達優(yōu)越密碼子結(jié)合的方式，因為采用單一因素會造成最優(yōu)密碼子確定的錯誤，如本研究中編碼天冬氨酸(Asp)的GAU密碼子雖然其URSC值均大于1，但其高表達密碼子的URSC值小于低表達蛋白編碼基因，這種僅采用高頻率密碼子分析法已被證明無法將高低表達編碼基因有效分開，當某些密碼子的高表達優(yōu)越性在總體上表現(xiàn)不突出時，這種優(yōu)越性易被湮滅[28]；同樣在編碼天冬氨酸的GAC密碼子，雖然其ΔURSC≥0.50，但其URSC值小于1，故而不可作為最優(yōu)密碼子，因此對最優(yōu)密碼子增加條件，使URSC值小于1.00的密碼子不能成為主要偏愛密碼子，就可有效獲得各植物葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子[16]。這對于從分子水平上研究物種進化具有重要的指導意義，同時對目標基因進行密碼子優(yōu)化以提高該基因在宿主細胞中的表達量，并通過的葉綠體基因工程對潛在新基因的功能進行預測。