余江泳　李曉瑞　劉貴珊　王梓　郭美　靳維一　董琪

摘 要：為研究不同蛋白酶對復(fù)合骨素（牛骨素和雞骨素）酶解液呈味物質(zhì)的影響，選取復(fù)合蛋白酶（P）、菠蘿蛋白酶（B）和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（F），制備單一和組合酶解液，對酶解液肽分子質(zhì)量分布、核苷酸含量、游離氨基酸含量等呈味物質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)。結(jié)果表明：P+F組酶解液的水解度最大，酶解液中小分子質(zhì)量肽（<200 Da）分布比例最大;P+F組酶解液的游離氨基酸含量最高，鮮味和甜味氨基酸是復(fù)合骨素酶解液的主要呈味成分;P+F組的5-核苷酸（5-肌苷酸、5-鳥苷酸、5-腺苷酸）總含量較高。因此，復(fù)合蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶處理的復(fù)合骨素酶解液整體風(fēng)味最佳。

關(guān)鍵詞：復(fù)合骨素;蛋白酶;酶解液;肽分布;核苷酸;游離氨基酸

Abstract： In order to investigate the effect of different proteases on taste compounds of enzymatic hydrolysates of a mixed bovine and chicken bone extract， protamex （P）， bromelain （B） and flavourzyme （F） were used singly and in combination for enzymatic hydrolysis. The resulting hydrolysates were evaluated by measuring their peptide molecular mass distribution， nucleotide and free amino acid contents as taste compounds. The results showed that P + F led to the highest degree of hydrolysis of the mixed extract and small peptides （< 200 Da） accounted for the highest proportion of total peptides in the hydrolysate. This hydrolysate contained the highest content of free amino acids with fresh and sweet amino acids being major taste compounds， as well as higher contents of total 5-nucleotides （5-inosinemonophosphate， 5-guanosinemonophosphate and 5-adeninemonophosphate）. Therefore， P + F treatment imparted the best flavor in enzymatic hydrolysates.

Keywords： mixed chicken and bovine bone extract; proteases; enzymatic hydrolysates; peptide distribution; nucleotides; free amino acids

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200314-069

中圖分類號(hào)：TS201.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2020）05-0001-05

我國已成為世界肉類生產(chǎn)和消費(fèi)大國，肉制品骨副產(chǎn)物的年產(chǎn)量2 000多萬t，骨資源極為豐富。骨中富含維生素、礦物質(zhì)、鈣磷鹽等天然營養(yǎng)成分，加工利用價(jià)值較高[1]。目前，骨加工設(shè)備和技術(shù)水平有限，大多數(shù)骨經(jīng)過粗加工直接作為動(dòng)物飼料，骨資源利用率較低。因此，提高骨附加值，開發(fā)天然綠色骨產(chǎn)品，對增加肉類企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義[2]。

骨類產(chǎn)品主要有骨素、骨泥、骨粉等，其中骨素是以畜禽骨為原料，經(jīng)過加熱浸提、離心分離油脂后濃縮制得的一種富含氨基酸、微量元素、風(fēng)味物質(zhì)的初級(jí)骨提取物，是生產(chǎn)肉類呈味基料的優(yōu)質(zhì)原料[3]。目前，骨素及骨提取物在食品調(diào)味料生產(chǎn)、骨類產(chǎn)品開發(fā)中逐漸成為研究熱點(diǎn)。唐春紅等[4]分析雞骨素酶解液酶解產(chǎn)物的風(fēng)味和功能組分生成機(jī)制，為雞骨的加工利用提供了理論依據(jù);Xu Xinru等[5]在牛骨提取物的水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了呈味物質(zhì)，表明寡肽在肉湯中具有風(fēng)味增濃、增香的作用;Sun Hongmei等[6]研究雞骨酶解后的骨提取物風(fēng)味品質(zhì)，結(jié)果表明，酶解過程增加了鮮味，改善了苦味，提高了酶解液風(fēng)味的整體穩(wěn)定性。因此，酶解過程不但可以使骨提取物中的多肽和游離氨基酸等呈味物質(zhì)最大限度地保留，而且對改善后期得到的香精香料風(fēng)味具有重要作用[7]。目前多數(shù)研究報(bào)道集中在單一骨素酶解液的滋氣味成分特性方面，關(guān)于以復(fù)合骨素為原料的酶解液呈味物質(zhì)組分研究鮮見報(bào)道。

本研究將牛骨素和雞骨素復(fù)合，制備肉味更加濃郁、滋味更加醇厚的復(fù)合骨素，選取復(fù)合蛋白酶、菠蘿蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶，制備單一和組合酶解液，利用高效液相色譜儀、氨基酸自動(dòng)分析儀等設(shè)備對酶解液核苷酸含量、肽分子質(zhì)量分布、游離氨基酸含量等呈味物質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)，為復(fù)合骨素的酶解、酶解液呈味物質(zhì)的組分分析以及骨副產(chǎn)物高值化加工利用、衍生產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清湯型牛骨素和雞骨素 撫順獨(dú)鳳軒骨神生物技術(shù)股份有限公司;復(fù)合蛋白酶（47 500 U/g）、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶500 MG（25 000 U/g）、菠蘿蛋白酶（600 000 U/g）（均為食品級(jí)） 丹麥諾維信公司;葡萄糖（食品級(jí)） 源葉生物科技有限公司。

2-甲基-3-庚酮、混合氨基酸、5-鳥苷酸（5-guanosinemonophosphate，5-GMP）、5-肌苷酸（5-inosinemonophosphate，5-IMP）、5-腺苷酸（5-adeninemonophosphate，5-AMP）、肽（甘氨酸、抑肽酶、細(xì)胞色素C、桿菌肽、谷胱甘肽）標(biāo)準(zhǔn)品?美國Sigma公司;甲醛、氫氧化鈉、磺基水楊酸、鹽酸、磷酸二氫鉀、三氟乙酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、JI-1精密增力電動(dòng)攪拌器 國華電器有限公司;1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Sniffer 9000嗅聞儀 瑞士Brechbuhler公司;DB-wax毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國J&W公司;TSK gel G2000 SWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm，5 μm） 日本Tosoh公司;Kjeltec-8100全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥Foss公司;L-8900氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合骨素酶解液的制備

選取牛骨素70 g、雞骨素30 g，添加100 mL蒸餾水進(jìn)行稀釋，在自然pH值條件下采用6 組酶進(jìn)行處理，按表1的條件酶解，水浴1 h后，再90 ℃水浴滅酶10 min，制得6 種復(fù)合骨素酶解液。P+F、B+F和P+B+F復(fù)配酶的酶活力比分別為1∶1、1∶1和1∶1∶2。

1.3.2 水解度測定

采用甲醛滴定法[8]測定復(fù)合骨素酶解液氨基酸態(tài)氮含量。準(zhǔn)確吸取5 mL酶解液至容量瓶，用蒸餾水定容至100 mL，取20 mL稀釋液加入60 mL蒸餾水混勻，在磁力攪拌器攪拌狀態(tài)下，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至pH 8.2，加入10 mL甲醛溶液后繼續(xù)滴定至pH 9.2，記錄消耗的NaOH溶液體積。以80 mL蒸餾水為對照，在相同條件下進(jìn)行空白滴定實(shí)驗(yàn)。氨基酸態(tài)氮含量按式（1）計(jì)算。

V為吸取試樣的體積/mL;V1為滴定時(shí)溶液pH 8.2～9.2所消耗的NaOH溶液體積/mL;V2為空白滴定實(shí)驗(yàn)中，溶液pH 8.2～9.2所消耗的NaOH溶液體積/mL;V3為參與反應(yīng)的稀釋液體積/mL;V4為稀釋液的定容體積/mL;c為NaOH溶液濃度（0.05 mol/L）;0.014為與1.00 mL NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量/g。

復(fù)合骨素酶解液總蛋白質(zhì)含量通過全自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測定，消化程序?yàn)?00 ℃消化30 min，升溫至420 ℃消化1 h。水解度按式（2）計(jì)算。

1.3.3 肽分子質(zhì)量分布測定

參照Chiang等[9]的方法，并稍作修改，采用高效液相色譜儀測定復(fù)合骨素酶解液分子質(zhì)量分布。測定條件：TSK gel G2000 SWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm，5 μm）;柱溫40 ℃;流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)45%乙腈（體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸配制）;0.5 mL/min恒流速洗脫;進(jìn)樣體積10 μL，檢測波長214 nm。以甘氨酸、抑肽酶、細(xì)胞色素C、桿菌肽、谷胱甘肽為標(biāo)準(zhǔn)品，建立保留時(shí)間（x）和分子質(zhì)量對數(shù)（y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=-3.933 1x+27.517 0，R2=0.999 8），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肽分子質(zhì)量。

1.3.4 游離氨基酸含量測定

參照Chungchunlam等[10]的方法，并稍作修改。取2 mL復(fù)合骨素酶解液及2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%磺基水楊酸于10 mL離心管內(nèi)，10 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液于50 mL離心管中，并用超純水定容，過0.22 μm濾膜，待氨基酸分析儀上機(jī)測定。

分析條件：色譜柱為日立專用離子交換樹脂柱（4.6 mm×60 mm，3 μm），檢測波長440 nm，0.2 mol/L檸檬酸鈉緩沖液，流速35 mL/h，柱溫31～76 ℃，茚三酮溶液流速25 mL/h，進(jìn)樣量20 ?L。游離氨基酸含量按式（3）計(jì)算。

1.3.5 核苷酸含量測定

參照Chen Dewei等[11]的方法，并稍作修改。取1 mL復(fù)合骨素酶解液于50 mL離心管內(nèi)，加入25 mL超純水，10 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液于50 mL離心管中，并用超純水定容，過0.22 μm濾膜，用高效液相色譜儀測定5′-IMP、5′-GMP和5′-AMP含量。

色譜條件：色譜柱為TSK-gel ODS-80TM（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，紫外檢測波長254 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL/min;流動(dòng)相：流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為pH 5.4、0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液;流動(dòng)相經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，在室溫下超聲脫氣30 min。采用二元流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫分離;流動(dòng)相A、B體積比：0 min時(shí)0∶100，11 min時(shí)10∶90，18 min時(shí)0∶100，23 min時(shí)0∶100;檢測時(shí)間23 min。

以峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算5-核苷酸（5-IMP、5-GMP和5-AMP）含量。5-IMP回歸方程為y=103 764x-96 588（R2=0.999 9），5-GMP回歸方程為y=139 286x-116 903（R2=0.999 8），5-AMP回歸方程為y=297 755x-183 539（R2=0.999 9）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析（P<0.05）;采用Origin 2018軟件繪圖;每個(gè)實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)進(jìn)行3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類對復(fù)合骨素酶解液水解度的影響

小寫字母不同，表示差異顯著（P<0.05）。

由圖1可知，P+F組復(fù)合骨素酶解液水解度與其他處理組差異顯著（P<0.05），且水解度最大，達(dá)11.27%。原因可能是復(fù)合蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的酶解條件較為相似，能夠配合發(fā)揮最大水解功效[12]。P、B、F、

B+F及P+B+F組5 個(gè)處理組間水解度差別不大，分別為9.19%、8.40%、8.88%、8.40%和9.39%。復(fù)合蛋白酶是由內(nèi)切蛋白酶、外切肽酶及風(fēng)味蛋白酶復(fù)合而成的，切割位點(diǎn)較多[13]，因此含有復(fù)合蛋白酶的P、

P+F和P+B+F組水解度高于無復(fù)合蛋白酶的B、F和B+F組。此外，菠蘿蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶，又名巰基蛋白酶，主要作用于肽鏈中精氨酸和賴氨酸的羧基端，所得酶解液水解度較低[14-15]。

2.2 酶種類對復(fù)合骨素酶解液肽分子質(zhì)量分布的影響

復(fù)合骨素經(jīng)酶解后生成的前體物質(zhì)肽，可以與氨基酸、核苷酸等風(fēng)味前體物質(zhì)發(fā)生一系列反應(yīng)，產(chǎn)生更為豐富的揮發(fā)性芳香物質(zhì)[16]。呈味肽主要分為多肽和寡肽，是從食物中提取或由氨基酸合成的，其中賦予肉品滋味的主要是分子質(zhì)量小于1 000 Da的寡肽，寡肽與其他呈味物質(zhì)會(huì)發(fā)生協(xié)同作用，可以豐富酶解液風(fēng)味，從而使口感適宜[17]。

由表2可知，復(fù)合骨素酶解液小分子質(zhì)量肽（<200 Da）分布比例較大，且P+F組高于其他各處理組。小分子肽對呈味效果具有重要影響，它們不但是鮮味和風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者，而且有的低聚肽是甜味的

主要來源，可以協(xié)調(diào)其他呈味物質(zhì)，使滋味更加自然、醇厚[18-19]。分子質(zhì)量200～1 000 Da肽的分布比例隨著肽分子質(zhì)量的增加而減小，這是由于大多數(shù)小分子質(zhì)量肽是肉滋味的主要呈味物質(zhì)，與其他分子質(zhì)量的肽相比，小分子質(zhì)量肽分布比例最大[20]。復(fù)合骨素酶解液中小分子質(zhì)量肽所占比例越大，代表其水解程度越高，酶解效果越好，其中P+F組分子質(zhì)量小于1 000 Da的肽段分布比例最高，說明該處理組的2 種酶之間存在一定的肽鍵互補(bǔ)性[21]，水解度大、酶解效果好，這與水解度分析結(jié)果一致。

2.3 酶種類對復(fù)合骨素酶解液游離氨基酸含量的影響

游離氨基酸既是食品中重要的營養(yǎng)成分之一，也是重要的呈味物質(zhì)和風(fēng)味前體物質(zhì)，能與其他營養(yǎng)成分產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而改善食品的整體風(fēng)味[22]。

由表3可知，6 組蛋白酶處理的酶解液中總共檢測出17 種游離氨基酸，其中必需氨基酸7 種、半必需氨基酸4 種。不同酶解液間的游離氨基酸總含量具有較大差異，含量從高到低依次為：P+F組>P+B+F組>F組>B+F組>P組>B組。P+F組的游離氨基酸總含量較高，這是由于含有復(fù)合蛋白酶的處理組水解度最大，因此在酶解過程中產(chǎn)生的游離氨基酸最多[23]。

呈味氨基酸的含量往往決定了動(dòng)物蛋白質(zhì)的鮮美程度。根據(jù)游離氨基酸結(jié)構(gòu)特性的不同，常常會(huì)呈現(xiàn)出鮮味、甜味、苦味等風(fēng)味，其中鮮味氨基酸和甜味氨基酸是良好的呈味基料，并且含量越高，得到的酶解液滋味越豐富[24-25]。天冬氨酸和谷氨酸是呈現(xiàn)鮮味的氨基酸，其鈉鹽具有很強(qiáng)的鮮味，類似味精，有助于改善酸味[26]。P+F組酶解液的天冬氨酸和谷氨酸含量均顯著高于其他5 個(gè)處理組（P<0.05），這對改善酶解液的滋味特征具有重要貢獻(xiàn)。蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸及脯氨酸主要呈現(xiàn)甜味，含有復(fù)合蛋白酶處理組上述5 種游離氨基酸總含量較高，其中甘氨酸可以降低酶解液的苦味，改善產(chǎn)品最終的風(fēng)味效果，丙氨酸可以與鮮味氨基酸相互作用，使肉類產(chǎn)品獲得更多的鮮味感[27]。在其余游離氨基酸中，呈現(xiàn)苦味的游離氨基酸種類較多，其中苯丙氨酸含量明顯高于其他游離氨基酸，同時(shí)苦味氨基酸會(huì)促進(jìn)其他游離氨基酸呈現(xiàn)出較好的鮮味和甜味[28]。半胱氨酸、賴氨酸和酪氨酸屬于無味氨基酸，故對酶解液風(fēng)味無影響。徐欣如等[29]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合蛋白酶+復(fù)合風(fēng)味蛋白酶組合酶解所得牛骨素酶解液鮮味氨基酸含量最高，制備出的香精味感圓潤、柔和，是最佳的組合酶，本研究與其結(jié)果一致。

2.4 酶種類對復(fù)合骨素酶解液呈味核苷酸含量的影響

5-核苷酸是核苷酸中主要的呈鮮味物質(zhì)，也是引起酶解產(chǎn)物風(fēng)味差異的重要原因，從而有助于提升肉質(zhì)鮮味[30]。對3 種5-核苷酸（5-IMP、5-GMP和5-AMP）含量進(jìn)行測定，由表4可知，復(fù)合骨素酶解液總核苷酸含量為13.08～15.08 mg/100 mL，其中5-IMP含量明顯高于5-GMP和5-AMP含量，這是由于5-IMP主要存在于動(dòng)物源食品中，5-GMP則是植物源食品中的主要呈鮮味物質(zhì)，而5-AMP是5-ATP的降解產(chǎn)物，故含量較低[31]。不同酶處理組復(fù)合骨素酶解液的核苷酸含量一般遵循水解度越大，含量越高的規(guī)律，B組的水解度最低，但是總核苷酸含量最高，P+F組的總核苷酸含量僅次于B組，可能是由蛋白酶的作用方式和酶切位點(diǎn)特異性造成的，因此不同酶之間存在一定差異性，后續(xù)酶解液產(chǎn)生的風(fēng)味也會(huì)有所不同[32]。

3 結(jié) 論

研究復(fù)合蛋白酶（P）、菠蘿蛋白酶（B）、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（F）、復(fù)合蛋白酶+復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（P+F）、菠蘿蛋白酶+復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（B+F）及復(fù)合蛋白酶+菠蘿蛋白酶+復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（P+B+F）6 組酶對復(fù)合骨素酶解液呈味物質(zhì)的影響。結(jié)果表明：P+F組復(fù)合骨素酶解液的水解度最大，達(dá)11.27%;酶解液中小分子質(zhì)量肽（<200 Da）分布比例最大，且P+F組高于其他處理組;P+F組酶解液的游離氨基酸總含量最高，鮮味和甜味氨基酸是復(fù)合骨素酶解液的主要呈味成分;P+F組的5′-核苷酸（5′-IMP、5′-GMP和5′-AMP）總含量較高，僅次于B組。因此，復(fù)合蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶組合可以增強(qiáng)復(fù)合骨素酶解液的鮮味和醇厚感，改善酶解產(chǎn)物的整體風(fēng)味，為研發(fā)復(fù)合骨衍生產(chǎn)品調(diào)味料基料提供理論參考。

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