方月月，解文利，潘肇儀，吳雨桐，周禮紅

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

中國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品是中華飲食的重要組成部分，發(fā)酵食品就是利用微生物發(fā)酵作用所生產(chǎn)的一類食品，發(fā)酵食品具有益生菌的特性,如抗菌性,抗氧化性等,可通過微生物的作用將對(duì)健康有益的成分傳遞給食用者[1]。發(fā)酵食品中的微生物與健康有密切的聯(lián)系，因此，揭示不同發(fā)酵食品中的微生物群落的分布狀態(tài)是必要的。鄭曉吉[2]利用Illumina-HiSeq測(cè)序技術(shù)揭示哈薩克族奶酪發(fā)酵過程不同成熟階段微生物群落的演替規(guī)律。研究結(jié)果表明Lactobacillus和Streptococcus是奶酪微生物群落中的共有細(xì)菌屬。陳聰聰[3]通過16S rDNA擴(kuò)增子高通量測(cè)序分析對(duì)廣陳皮樣品微生物多樣性進(jìn)行解析，研究結(jié)果揭示了細(xì)菌類群屬于厚壁菌門、藍(lán)細(xì)菌門和變形桿菌門。白光劍等[4]應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)分析成品甜芽菜中具有7個(gè)細(xì)菌門，包括放線菌門、擬桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門、厚壁菌門、梭桿菌門。折米娜等[5]利用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)相結(jié)合的手段對(duì)酸菜水中細(xì)菌多樣性研究中的微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，結(jié)果表明酸菜水中的細(xì)菌種類較為豐富，其中隸屬于硬壁菌門(Firmicutes)的乳桿菌屬(Lactobacillus)為優(yōu)勢(shì)屬。燕平梅等[6,7]利用DGGE方法研究醬菜中酵母菌多樣性，結(jié)果表明發(fā)酵醬菜中的酵母菌總共有3個(gè)屬，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)為優(yōu)勢(shì)菌種。利用非培養(yǎng)方法研究榨菜中酵母菌的多樣性，結(jié)果表明榨菜中有Candidatropicalis,Pichiafermentans,Saturnisporamendonce等酵母菌。

我國(guó)擁有很多風(fēng)味獨(dú)特的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，發(fā)酵體系中的微生物對(duì)于發(fā)酵食品的生產(chǎn)和風(fēng)味形成十分關(guān)鍵。目前對(duì)于我國(guó)一些發(fā)酵食品中微生物多樣性的認(rèn)識(shí)還十分有限[8]。本文報(bào)道了采用可培養(yǎng)方法對(duì)獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪中細(xì)菌區(qū)系進(jìn)行多樣性研究，研究結(jié)果為果蔬發(fā)酵食品的品質(zhì)提高和安全性控制提供了理論基礎(chǔ)，為傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)和開發(fā)提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品制備

獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪(酒精度為16%±1%)：實(shí)驗(yàn)室自制。

獼猴桃去雜、去壞果，將獼猴桃用鹽水浸泡30 min后去皮，打漿，加入30%的紅糖，裝瓶，在(25±1) ℃的溫度下自然發(fā)酵，當(dāng)酒精度達(dá)到16%±1%時(shí)進(jìn)行取樣。

1.2 藥品與試劑

細(xì)菌通用引物(BSF8/20、BSR1541/20)：生工生物工程(上海)股份有限公司合成。細(xì)菌DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、4S green核酸染色劑、DNA Marker-D：購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 主要設(shè)備與儀器

S1000 PCR擴(kuò)增儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)BIO-RAD公司；ABI 3730XL+全自動(dòng)DNA測(cè)序儀 美國(guó)ABI公司

1.4 培養(yǎng)基

西紅柿瓊脂培養(yǎng)基、西紅柿汁瓊脂培養(yǎng)基III、BCP培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基I[9-11]。

2 方法

2.1 細(xì)菌的分離

取獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪樣品10 g，放入盛有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩5 min，充分搖勻，稀釋制成10-1菌懸液。將制得的菌懸液梯度稀釋[12]。分別吸取濃度梯度為10-3，10-4，10-5的菌液100 μL置于倒好的平板上。將涂布后的平板置于(37±1) ℃靜置培養(yǎng)2 d，待培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出單個(gè)菌落，其中根據(jù)菌落大小、形態(tài)、顏色、表面的粗細(xì)、透明圈、粘稠度、高低、邊緣的形狀、菌塊的質(zhì)地等表型特征挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到相應(yīng)培養(yǎng)基斜面，(37±1) ℃培養(yǎng)2 d，用于菌體制備。

2.2 細(xì)菌16S rDNA序列分析

2.2.1 菌體制備

將(37±1) ℃培養(yǎng)2 d備用的細(xì)菌斜面菌種用無(wú)菌水洗下菌苔，加入到滅菌離心管中，以10000 r/min的速度離心15 s，再將菌體沉淀物用無(wú)菌水洗滌2次后用于模板制備。

2.2.2 DNA模版制備

使用購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司的Solarbio細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行提取DNA。

2.2.3 16S rDNA PCR擴(kuò)增

以BSF8/20(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、BSR1541/20(5′-AAGGAGGTGAACCAGCCGCA-3′)為引物，以細(xì)菌總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：DNA模版1 μL，2×Mix 13 μL，10 μmol/L BSF8/20 1 μL，10 μmol/L BSR1541/20 1 μL，ddH2O 9 μL，混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，2～4步循環(huán)30次，72 ℃延長(zhǎng)10 min。

2.2.4 測(cè)序方法

DNA測(cè)序采用雙脫氧鏈終止法[13]。

2.2.5 序列分析

利用DNAman軟件拼接序列，啟動(dòng)Seqman，導(dǎo)入目標(biāo)序列(峰圖文件)，進(jìn)行數(shù)據(jù)修正，數(shù)據(jù)修正后點(diǎn)擊Assemble進(jìn)行拼接，若兩個(gè)峰圖的重疊區(qū)域完全匹配，則表明拼接的結(jié)果可靠；若兩個(gè)峰圖間有不同堿基，則需要比對(duì)兩個(gè)峰圖，選擇峰圖清晰的作為最終結(jié)果。

采用lgBLASTN(1.14.0)程序搜索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，下載得分高、序列相似性達(dá)到95%以上相關(guān)菌株的16S rDNA序列，選擇的菌株盡可能來(lái)源于保藏機(jī)構(gòu)。采用MEGA 10.0.5軟件進(jìn)行序列比對(duì)及聚類分析。

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法：利用MEGA 10.0.5軟件的N-J法重構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹，采用bootstrap檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，bootstrap檢驗(yàn)1000次。在不同種類的細(xì)菌菌株中選取代表菌株，采用N-J法將每一類代表菌株序列與GenBank中的模式菌株序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得分離菌株的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育地位(neighbor-joining method，取1000次bootstrap檢驗(yàn))[14-16]。

2.3 α多樣性分析

利用R語(yǔ)言(R version 3.5.3 )軟件中Spaa包(spaa_0.2.2)和Vegan包(vegan 2.5-4)分析獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪微生物的α多樣性，包括Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Inverse Simpson指數(shù)、物種累計(jì)數(shù)(S)、Pielou 均勻度指數(shù)(J)。

3 結(jié)果與分析

3.1 果蔬自然發(fā)酵期間發(fā)酵醪中細(xì)菌的鑒定

從獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪中共分離得到49株細(xì)菌菌株，經(jīng)對(duì)菌株16S rDNA序列進(jìn)行測(cè)序、分析，并利用MEGA軟件對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行聚類。49株細(xì)菌菌株分別聚成11個(gè)獨(dú)立類群(見圖1)，提示在獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪中可能存在多個(gè)不同的細(xì)菌種類，推測(cè)獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪有可能也是一個(gè)多菌株混合發(fā)酵的產(chǎn)物。

圖1 49株細(xì)菌菌株 16S rDNA序列的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of 16S rDNA sequences of 49 bacterial strains

在11個(gè)類群中，每一個(gè)獨(dú)立類群細(xì)菌菌株的數(shù)量存在差異。其中，第10類群細(xì)菌菌株數(shù)量最高，第1類群、第9類群和第11類群的細(xì)菌菌株數(shù)量相同，第5類群的細(xì)菌菌株數(shù)量最低。結(jié)果表明獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪中存在的不同類群細(xì)菌之間可能有特定的消長(zhǎng)關(guān)系。

3.2 11個(gè)細(xì)菌類群的鑒定

通過Blast對(duì)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)分析，獲得與聚類確定的11個(gè)細(xì)菌類群分別相匹配的、相似性大于95%的已知菌株16S rDNA序列。然后將待分析的11個(gè)細(xì)菌類群代表菌株的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)下載序列重構(gòu)N-J系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 細(xì)菌菌株16S rDNA序列的鄰結(jié)法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of neighborhood method for 16S rDNA sequence of bacterial strains

注：136為1類群代表菌株；209為2類群代表菌株；12為3類群代表菌株；53為4類群代表菌株；46為5類群代表菌株；34為6類群代表菌株；184為7類群代表菌株；25為8類群代表菌株；3為9類群代表菌株；78為10類群代表菌株；81為11類群代表菌株。

第1類群(代表株為136)與已知Serratiamarcescens菌株聚為一支，初步將第1類群鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。同理，根據(jù)N-J系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類方式，分別將第2類群至第11類群初步鑒定為：奧斯陸莫拉菌(Moraxellaosloensis)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、羅氏菌屬(Rothiasp.)、賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusmacroides)、Bacillusaryabhattai、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、黃熱芽孢桿菌(Anoxybacillusflavithermus)。11個(gè)細(xì)菌類群最后歸于5個(gè)屬，分別是芽孢桿菌屬(Bacillus)、莫拉菌屬(Moraxella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas)、羅氏菌屬(Rothiasp.)。

3.3 獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪細(xì)菌α多樣性分析

獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪細(xì)菌α多樣性分析表明，果蔬自然酒精發(fā)酵達(dá)到酒精濃度為16%±1%時(shí)，物種累計(jì)數(shù)(S)為10，PielouA均勻度指數(shù)(J)為0.874521，提示發(fā)酵醪細(xì)菌類群的物種多樣性相對(duì)較低；香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Wiener)為2.013659，辛普森指數(shù)(Simpson)為0.8229904，Inverse Simpson 指數(shù)為5.649412，提示發(fā)酵醪的細(xì)菌類群群落均勻度較低及物種豐富度較低。結(jié)果與Jiang等[17]報(bào)道的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜微生物的α多樣性一致。細(xì)菌多樣性指數(shù)分析見表1。

表1 細(xì)菌多樣性指數(shù)分析Table 1 Analysis of bacterial diversity index

4 結(jié)論與討論

通過對(duì)獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪中細(xì)菌的分離鑒定分析，其中49株細(xì)菌分屬于5個(gè)屬10個(gè)種。從香農(nóng)-威納指數(shù)、辛普森指數(shù)、Inverse Simpson 指數(shù)、Pielou 均勻度指數(shù)數(shù)據(jù)分析得知，獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪中細(xì)菌種類多樣性較低，豐富度和均勻度也較低，而物種累計(jì)數(shù)(S)表明果蔬發(fā)酵期間細(xì)菌物種數(shù)為10。因此，在獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪當(dāng)中盡管細(xì)菌的豐度較低，但是依然存在。自然發(fā)酵其實(shí)是一個(gè)微生物群落的共發(fā)酵，是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的微生物生態(tài)。

通過本研究可知獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪中蘊(yùn)含著豐富的微生物資源，其中蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌屬于可應(yīng)用于人體的益生菌，進(jìn)入腸道后通過生物奪氧作用，造成腸道低氧，拮抗腸道致病菌,促進(jìn)有益菌增長(zhǎng)，從而達(dá)到調(diào)節(jié)人體腸道環(huán)境的作用[18,19]。地衣芽孢桿菌也是高溫大曲產(chǎn)醬香功能細(xì)菌[20]。地衣芽孢桿菌可作為一種益生菌應(yīng)用于各類食品加工中，為傳統(tǒng)發(fā)酵食品產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了有利條件。