李蓉，姚國(guó)敏，姚楊

自噬（autophagy，AP）是一種普遍存在于真核生物中的、由溶酶體介導(dǎo)的降解細(xì)胞內(nèi)受損的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的正常代謝過(guò)程。作為維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)的一種自我保護(hù)機(jī)制，自噬已成為近年來(lái)生物學(xué)及生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-2]。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞自噬對(duì)炎癥反應(yīng)有重要的調(diào)控作用，而炎癥反應(yīng)也能影響細(xì)胞自噬[3]。視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium cells，RPE） 細(xì)胞是一種具有多種生理生化功能的細(xì)胞，病理?xiàng)l件下可分泌包括炎性因子在內(nèi)的多種細(xì)胞因子參與眼部疾病的發(fā)生[4]。炎性因子白細(xì)胞介素8（interlukin-8，IL-8）和 單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemokine protein 1，MCP-1）屬于趨化因子家族，與炎癥、機(jī)體免疫、腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。目前對(duì)于自噬與RPE 細(xì)胞功能的相互關(guān)系已有報(bào)道，但對(duì)自噬在RPE 細(xì)胞表達(dá)趨化因子IL-8 和MCP-1 中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察細(xì)胞自噬在缺氧條件下RPE 細(xì)胞表達(dá)IL-8 和MCP-1 中發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步研究自噬與眼部疾病的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

ARPE-19 細(xì)胞系（武漢普諾賽生命科技有限公司）；DMEM/F12 培養(yǎng)基及0.25%胰酶 （美國(guó)Gibco公司）；3-MA（美國(guó)Selleck 公司）；CQ（美國(guó)Sigma 公司）；兔多抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 B（microtubule associated protein 1 light chain 3B，LC3B）、兔 多 抗Beclin-1 及兔多抗p62 （美國(guó)CST 公司）；兔多抗GAPDH（杭州賢至生物有限公司）；HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；人IL-8 和MCP-1 ELISA 試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）。三氣培養(yǎng)箱 （上海力申科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)HF-100）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司，型號(hào)IX51）；微型高速離心機(jī)（美國(guó)Labnet 公司，型號(hào)C2500-R-230V）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo scientific 公司，型號(hào)Multiskan MK3）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理及分組 用不含EDTA 的0.25%胰酶消化ARPE-19 細(xì)胞，用DMEM/F12 培養(yǎng)基 （含10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素）終止消化，輕輕吹打混勻成單細(xì)胞懸液，傳代至培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19 細(xì)胞（5～10 代）按照每孔5×105個(gè)接種于6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞分為對(duì)照組、缺氧組、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）+缺氧組和缺氧組（簡(jiǎn)稱(chēng)：3-MA組）和氯喹（chloroquine，CQ）+缺氧組（簡(jiǎn)稱(chēng)：CQ組），其中對(duì)照組在常氧條件下培養(yǎng)；缺氧組置于O2：CO2：N2體積比為1∶5∶94 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3-MA組先用10 mM 3-MA 預(yù)處理細(xì)胞2 h，然后處理方法同缺氧組；CQ組先用50 μM預(yù)處理細(xì)胞2 h，然后處理同缺氧組。

1.2.2 RPE 細(xì)胞IL-8 和MCP-1 的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組方法如前，培養(yǎng)24 h 后將處理好的細(xì)胞加入ELISA 試劑盒的96 孔板中，每孔加入100 μL，蓋上封紙，置于37℃孵育90 min。孵育結(jié)束后，移出液體，不清洗，每孔加100 μL 稀釋后的檢測(cè)試劑A，封口，置于37℃孵育1 h，孵育結(jié)束后，移出液體，用350 μL 的洗脫液將96 孔板洗3 次，每次清洗液在孔中停留1～2 min，吸干液體，于每孔加100 μL 稀釋后的檢測(cè)試劑B，封口，37℃孵育30 min，結(jié)束后，移出液體，用350 μL 洗脫液將96 孔板洗4 次，洗脫方法如前，吸干液體，于每孔中加100 μL 底物溶液，蓋上封紙，孵育15 min，結(jié)束后，于每孔加入100 μL 終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的光密度（OD）值。以IL-8 和MCP-1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，OD 值為橫坐標(biāo)，做直線(xiàn)相關(guān)回歸，據(jù)待測(cè)樣本的OD 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出該樣本的IL-8 和MCP-1 濃度對(duì)應(yīng)值。

1.2.3 RPE 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS 洗滌3 次，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液400 μL，混勻，4℃、1300 r/min 離心15 min，取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，取50 μg 等量蛋白上樣。SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液室溫封閉2 h，TBST 洗滌3 次，每次10 min。加入一抗LC3B （1:1000）、Beclin-1（1:1000）、p62（1:1000）及GADPH（1:1000，4℃搖 床 過(guò)夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗（1:50000），室溫孵育2 h，洗膜后顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。以GAPDH 為內(nèi)參，以目的蛋白/GAPDH 條帶灰度值作為其相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARPE-19 細(xì)胞形態(tài)

培養(yǎng)24 h，ARPE-19 細(xì)胞呈現(xiàn)扁圓形、梭形、多角形或者不規(guī)則形的細(xì)胞形態(tài)，貼壁良好，胞漿內(nèi)未見(jiàn)明顯黑色素顆粒。不同處理組之間的細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯差異，但3-MA組和CQ組凋亡細(xì)胞數(shù)量增多（圖1）。

圖1 4組ARPE-19 細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)（×100）。1A 對(duì)照組；1B 缺氧組；1C 3-MA組；1D CQ組

2.2 RPE 細(xì)胞中IL-8 和MCP-1 蛋白的表達(dá)

ELISA 檢測(cè)各組ARPE-19 細(xì)胞上清液中IL-8、MCP-1 水平，對(duì)照組、缺氧組、3-MA組、CQ組的IL-8 濃度（pg/mL）分別為28.98±3.66、129.95±2.29、100.47±4.03 和54.94±3.27；4組細(xì)胞的MCP-1 濃度 （pg/mL） 分別為170.33±9.31、526.65±52.43、390.87±44.18 和301.73±4.13。結(jié)果顯示培養(yǎng)的細(xì)胞在正常的情況下僅僅產(chǎn)生少量的IL-8 和MCP-1，在缺氧條件下，細(xì)胞表達(dá)的IL-8 和MCP-1 迅速增加，而3-MA 或CQ 預(yù)處理可以明顯抑制IL-8、MCP-1蛋白的分泌（圖3）。4組比較，IL-8：F＝539.27，P＝0.000；MCP-1：F＝56.16，P＝0.000，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，缺氧組的IL-8、MCP-1 濃度明顯高于對(duì)照組、3-MA組和CQ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（IL-8：均P=0.000；MCP-1：缺氧組vs.對(duì)照組，P=0.000；缺氧組vs.3-MA組，P=0.001；缺氧組vs.CQ組，P=0.000）（圖2）。

圖2 ELISA 檢測(cè)四組細(xì)胞表達(dá)IL-8 和MCP-1 蛋白濃度的比較。2A IL-8 蛋白濃度比較；2B MCP-1 蛋白濃度比較。IL-8：白細(xì)胞介素-8；MCP-1：?jiǎn)魏思?xì)胞趨化蛋白-1

2.3 各組RPE 細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3B-II/I、Beclin-1 和p62 的表達(dá)

Westernblot 檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、缺氧組、3-MA組和CQ組細(xì)胞中的LC3B-II/I、Beclin-1 及p62 的相對(duì)蛋白表達(dá)量分別為 （0.24±0.02、0.50±0.05、0.34±0.01 和0.67±0.05）、（0.32±0.03、0.97±0.05、0.78±0.06 和0.54±0.01）和（1.03±0.02、0.32±0.10、0.78±0.08 和0.96±0.02）。與對(duì)照組比較，缺氧組細(xì)胞自噬水平升高，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3B-II/I 比值、Beclin-1這兩種蛋白表達(dá)增加和p62 蛋白表達(dá)下降。與缺氧組比較，采用自噬抑制劑3-MA 預(yù)處理細(xì)胞時(shí)，LC3B-II/I 和Beclin-1 的表達(dá)明顯下降，p62 的表達(dá)明顯增加；采用自噬抑制劑CQ 預(yù)處理細(xì)胞，Beclin-1 的表達(dá)明顯下降，LC3B-II/I 和p62 的表達(dá)明顯增加（圖3）。

4組間比較差異，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LC3B-II/I：F ＝80.65，P ＝0.000；Beclin-1：F ＝139.29，P＝0.000；p62：F＝70.64，P＝0.000）。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，缺氧組中LC3B-II/I 的相對(duì)蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組和3-MA組（缺氧組vs.對(duì)照組，P＝0.000；缺氧組vs.3-MA組，P=0.001）；缺氧組中LC3B-II/I 的相對(duì)蛋白表達(dá)量低于CQ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000）。缺氧組細(xì)胞中Beclin-1 的相對(duì)蛋白表達(dá)量均明顯高于其它3組（缺氧組vs.對(duì)照組，P＝0.000；缺氧組vs.3-MA組，P=0.001；缺氧組vs.CQ組，P＝0.000）。缺氧組中p62 相對(duì)蛋白表達(dá)量明顯低于其它3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）（圖4）。

3 討論

圖3 Westernblot 檢測(cè)四組細(xì)胞LC3B、Beclin-1 和p62 的蛋白條帶圖

圖4 四組細(xì)胞LC3B-II/ I、Beclin-1 和p62 的相對(duì)蛋白表達(dá)量比較。4A LC3B-II/I 相對(duì)蛋白表達(dá)量；4B Beclin-1 相對(duì)蛋白表達(dá)量；4C p62 的相對(duì)蛋白表達(dá)量

RPE 是眼底一層重要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其分泌的許多細(xì)胞因子對(duì)維持眼內(nèi)微環(huán)境具有重要作用。在病理狀態(tài)下，RPE 細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-4、IL-6、IL-8、IL-10 和MCP-1 等多種炎性細(xì)胞因子參與增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變 （proliferative vitreoretinopathy，PVR）、年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）及糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）等的發(fā)生和發(fā)展[5]。細(xì)胞自噬與炎癥關(guān)系密切，其機(jī)制涵蓋多個(gè)方面[6-7]，并且近年來(lái)研究表明，細(xì)胞自噬在眼部疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[3，8-9]。因此，本研究以ARPE-19 細(xì)胞分泌的趨化因子IL-8 和MCP-1 為檢測(cè)指標(biāo)，探討自噬是否通過(guò)影響RPE 細(xì)胞分泌炎癥因子而參與眼部疾病的發(fā)生。

趨化因子（chemokines）是一類(lèi)由組織細(xì)胞或炎性細(xì)胞衍生的、對(duì)各種白細(xì)胞有趨化活性和激活功能的細(xì)胞因子，能選擇性地引導(dǎo)白細(xì)胞亞類(lèi)的定向游走和組織內(nèi)聚集。趨化因子與相應(yīng)受體結(jié)合后主要通過(guò)G 蛋白偶聯(lián)的磷脂酰肌醇途徑而發(fā)揮免疫炎性和血管生成等多種生物活性。自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，趨化因子與腫瘤的關(guān)系一直是研究的熱點(diǎn)。趨化因子超家族與相應(yīng)受體結(jié)合可影響多種惡性腫瘤的進(jìn)展、生物學(xué)行為和疾病預(yù)后。IL-8、MCP-1 均為具有重要生理作用的趨化因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中起著復(fù)雜的作用。一般而言，陽(yáng)性表達(dá)者進(jìn)展快，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)量高，血管生成密度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，侵襲能力強(qiáng)及預(yù)后差[10-11]。IL-8 是Yoshimur 在1987年發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)首個(gè)趨化因子，目前它是研究最多、促進(jìn)血管生成作用最強(qiáng)的一種趨化因子[12]。在許多腫瘤組織中均能檢測(cè)到IL-8 的高表達(dá)和分泌，而在相應(yīng)的正常組織中IL-8 不表達(dá)或低表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-8 具有誘導(dǎo)腫瘤血管增生，調(diào)節(jié)血管增殖及滲透性，與多種腫瘤的生長(zhǎng)浸潤(rùn)，轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散有關(guān)[12-13]。MCP-1 是主要的吸引單核/巨噬細(xì)胞到炎癥、腫瘤部位的趨化因子，一方面能介導(dǎo)局部的免疫炎性反應(yīng)，即趨化和激活單核/巨噬細(xì)胞，使之產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子并放大這一過(guò)程；另一方面能夠誘導(dǎo)和刺激病理性血管生成[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常的情況下，RPE細(xì)胞僅產(chǎn)生少量的IL-8 和MCP-1。在缺氧條件下，細(xì)胞表達(dá)的IL-8 和MCP-1 迅速增加，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似[5]。隨著近年來(lái)對(duì)腫瘤血管生成的廣泛研究，人們發(fā)現(xiàn)各種多種生長(zhǎng)因子都具有血管生成的功能。除內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF 家族和血管生成素家族之外，血管生成相關(guān)性趨化因子和細(xì)胞因子被認(rèn)為其有很強(qiáng)的促血管生成活性。因此，缺氧促進(jìn)RPE 細(xì)胞表達(dá)IL-8 和MCP-1，可能進(jìn)一步參與眼部新生血管的形成。

作為普遍存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的一種機(jī)制，細(xì)胞自噬能對(duì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定進(jìn)行自我維持，且在胚胎發(fā)育、細(xì)胞自我保護(hù)和生存等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞的自噬水平會(huì)在短時(shí)間內(nèi)迅速升高。自噬的發(fā)生需要多種自噬相關(guān)蛋白參與，任何一種自噬基因的缺失或突變都會(huì)影響自噬相關(guān)進(jìn)程，從而造成各種眼病的發(fā)生[16]，例如白內(nèi)障，AMD，青光眼，葡萄膜炎，視網(wǎng)膜疾病和眼腫瘤等。作為自噬標(biāo)記蛋白，LC3，Beclin-1 和p62 等被廣泛用于自噬的相關(guān)研究中，在研究中常結(jié)合起來(lái)綜合判斷自噬活性的強(qiáng)弱[17-19]。已有研究發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白在視網(wǎng)膜色素上皮層、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層均有強(qiáng)烈表達(dá)[20]，當(dāng)自噬調(diào)節(jié)處于失調(diào)狀態(tài)時(shí)會(huì)導(dǎo)致相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，在不同培養(yǎng)條件下，RPE 細(xì)胞中LC3、Beclin-1及p62 蛋白都有不同程度的表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。另外，鑒于不同自噬抑制劑的作用機(jī)制存在差異，本研究采用了兩種自噬抑制劑對(duì)RPE 細(xì)胞進(jìn)行了干預(yù)。其中，3-MA 是Class III PI3K 的抑制劑，它作用于自噬誘導(dǎo)階段，可特異性阻斷自噬體的形成[21]。CQ是一種溶酶體自噬抑制劑，可阻止自噬體與溶酶體的結(jié)合，抑制自噬的降解，使得自噬體在細(xì)胞內(nèi)增加，作用后使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換增加更明顯[22]。本研究發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，RPE 細(xì)胞的LC3B-II/I（LC3B 是LC3 的主要亞型）、Beclin-1 蛋白表達(dá)增加及p62 蛋白表達(dá)下降，而3-MA 或CQ 處理后這3種自噬關(guān)鍵蛋白的表達(dá)明顯發(fā)生改變，證實(shí)缺氧誘導(dǎo)了RPE 細(xì)胞的自噬激活。

缺氧刺激可促進(jìn)RPE 細(xì)胞IL-8 和MCP-1 表達(dá)，3-MA 或CQ 處理后減少了二者的表達(dá)。3-MA和CQ 預(yù)處理得到的結(jié)果一致，提示抑制自噬能減少RPE 細(xì)胞表達(dá)IL-8 和MCP-1。結(jié)合以往的研究結(jié)果，即缺氧條件下自噬激活可促進(jìn)視網(wǎng)膜血管生成過(guò)程[23-24]，提示自噬激活促進(jìn)RPE 細(xì)胞分泌趨化因子IL-8 和MCP-1 可能是自噬參與視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管形成的另一重要途徑。目前，通過(guò)調(diào)控自噬進(jìn)程治療眼部疾病已成為一種嶄新的思路，故更深入了解自噬對(duì)RPE 細(xì)胞分泌IL-8 和MCP-1 的具體調(diào)控機(jī)制很有可能為治療視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管等眼病提供新方法。