張佳良，桑子瑾，吳烈，吳文婷，張婷婷，張億

視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO) 是第二大致盲性眼底血管性疾病，其中視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion，BRVO)約占5/6，且其發(fā)病率仍在逐年增加［1］。由于BRVO 具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，病程冗長，并發(fā)癥較多，嚴(yán)重影響視力，目前尚無有效治療方法[2]。通過建立合理的BRVO動(dòng)物模型，對BRVO 的探索研究具有重要意義。目前建立實(shí)驗(yàn)性BRVO 的模型有多種，不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟捎玫姆椒ê图夹g(shù)參數(shù)也不同，其中應(yīng)用光化學(xué)法誘導(dǎo)該模型的研究較多，但技術(shù)操作未形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化方案。為進(jìn)一步完善操作技術(shù)，采用以熒光素鈉為光敏劑的光化學(xué)方法建立的新西蘭兔實(shí)驗(yàn)性BRVO 模型，取得較滿意的結(jié)果，該造模方法操作簡單，眼底觀察方便，病理改變與臨床BRVO 相似，并通過對造模后連續(xù)觀測與單點(diǎn)觀測的結(jié)果比較，來驗(yàn)證多次實(shí)驗(yàn)外部干預(yù)是否會(huì)對模型病變及病程產(chǎn)生影響，為后期RVO 治療的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究篩選出更好的造模方案，現(xiàn)總結(jié)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康成年清潔級(jí)新西蘭兔40只（中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（京）2014-0012），體重2.5～3.0 kg，兔齡12～16 個(gè)月，無眼疾患，雌雄兼用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 戊巴比妥鈉（美國Sigma 公司）；熒光素鈉注射液（廣州白云山明興制藥有限公司）；復(fù)方托吡卡胺滴眼液（北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；多聚甲醛（上海源聚生物科技有限公司）。

1.1.3 主要設(shè)備VISULAS 532s（德國ZEISS 公司）；光學(xué)相干斷層掃描儀（日本Topcon 公司）；眼底熒光血管造影儀（fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA）（德國Heidelberg 公司）；Olympus BX51 光學(xué)顯微鏡（日本OLMPUS 公司）。

1.2 動(dòng)物分組

按照動(dòng)物編號(hào)隨機(jī)分組，雌雄各半，第1組：8只，用于3、7、14 和21 d 的持續(xù)FFA 檢測；第2組：24 只，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6 只，分別于3、7、14 和21 d 不同時(shí)間點(diǎn)觀測FFA；第3組：8 只，不造模作為正常對照組。最后分別在7、14、21 和28 d 摘除兔眼球做病理切片。

1.3 模型建立

將實(shí)驗(yàn)兔適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后造模，用復(fù)方托吡卡胺滴眼液點(diǎn)右眼散瞳至瞳孔直徑約5～6 mm，鹽酸利多卡因表面麻醉，按1 ml/kg 的劑量頭皮針經(jīng)兔耳緣靜脈注入3%的戊巴比妥溶液麻醉并留置頭皮針，將實(shí)驗(yàn)兔固定置于激光機(jī)前，放置三面鏡觀察眼底，經(jīng)耳緣靜脈注射10%熒光素鈉注射液（0.3 ml/kg），找出與視網(wǎng)膜動(dòng)脈相伴行的靜脈，應(yīng)用532 激光，波長530 nm，能量100～300 mW，光斑直徑100～300 μm，持續(xù)時(shí)間0.2～0.5 s，光凝點(diǎn)選在距離視盤0.5 DD（視盤直徑長度）外的分支靜脈處。先以較小光斑小能量光凝靜脈選定點(diǎn)的遠(yuǎn)端，然后光凝靜脈選定點(diǎn)的近端，見靜脈收縮局部變白血流中斷后，再以較大光斑大能量光凝兩點(diǎn)中央?yún)^(qū)，形成一段約1/3 DD 的靜脈血栓區(qū)域。每只實(shí)驗(yàn)兔光凝右眼，根據(jù)需要分別光凝一側(cè)或兩側(cè)分支靜脈，每支靜脈平均光凝約30 點(diǎn)，同時(shí)避開伴行的動(dòng)脈。

1.4 眼底影像學(xué)檢查

1.4.1 眼底彩色照相 實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)激光光凝后，在靜脈麻醉狀態(tài)下置于OCT 儀前方固定好，以視盤為中心，找好角度進(jìn)行拍攝。

1.4.2 FFA 檢查 激光光凝后即刻或在3、7、14、21 d不同觀測時(shí)間點(diǎn)，將靜脈麻醉狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)兔置于造影機(jī)前，自兔耳緣靜脈快速注入10%熒光素鈉注射液（0.1 ml/kg），調(diào)整焦距和亮度，待熒光素鈉循環(huán)至眼底，以視盤和激光光凝點(diǎn)為中心進(jìn)行熒光素鈉血管造影檢查，觀察眼底視網(wǎng)膜靜脈阻塞、側(cè)支循環(huán)建立以及損傷血管再通情況[3-4]。

1.5 組織病理學(xué)

造模后分別在7、14、21 和28 d 四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將實(shí)驗(yàn)兔用空氣栓塞法處死，摘除眼球，10%福爾馬林溶液固定，眼球壁石蠟包埋切片，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取臨近光凝部位的6 張切片，HE 常規(guī)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)每張切片在400 倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)不同視野，統(tǒng)計(jì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的密度及外核層細(xì)胞層數(shù)的變化情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間的兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜眼底觀察

激光光凝視網(wǎng)膜靜脈分支時(shí)，可見血流逐漸變慢至單個(gè)紅細(xì)胞通過光凝變窄處，隨后血流停止，靜脈阻塞形成；造模后在接觸鏡和檢眼鏡下均可見光凝點(diǎn)遠(yuǎn)端靜脈擴(kuò)張、迂曲、顏色加深，相應(yīng)區(qū)域出現(xiàn)輕度灰白色混濁、水腫，有些兔阻塞靜脈的周圍有小片狀出血。

眼底照相：光凝血管收縮變細(xì)，血柱變窄甚至消失，光凝靜脈呈臘腸樣節(jié)段狀閉鎖，毗鄰視網(wǎng)膜呈灰白色水腫或見散在出血，受阻靜脈直至終末小靜脈明顯迂曲擴(kuò)張，阻塞區(qū)供應(yīng)動(dòng)脈痙攣性收縮變細(xì)（圖1）。

圖1 實(shí)驗(yàn)兔光凝后彩色眼底照相。可見光凝處靜脈血流阻斷（黑箭頭所示）遠(yuǎn)端血管擴(kuò)張，毗鄰視網(wǎng)膜呈灰白色水腫，周圍可見散在出血點(diǎn)

2.2 FFA 檢查

模型組熒光素鈉注入后約5 s 時(shí)視網(wǎng)膜靜脈內(nèi)熒光素開始充盈，激光光凝的靜脈熒光素充盈緩慢，光凝點(diǎn)有熒光滲漏，遠(yuǎn)端靜脈擴(kuò)張、迂曲，近端無熒光素充盈。FFA 圖片可見造模眼出現(xiàn)熒光遮蔽現(xiàn)象，以及光凝的靜脈周圍存在多少不等的熒光素滲漏（圖2）。

不同時(shí)間點(diǎn)各組造模后FFA 結(jié)果示：連續(xù)觀測組中，3 d 時(shí)FFA 顯示有熒光遮蔽和滲漏現(xiàn)象，光凝處局部無灌注；7 d 時(shí)光凝處血管變迂曲，滲漏區(qū)縮??；14 d 時(shí)血管仍為迂曲狀，但回流開始增加，損傷部位血管有熒光素著染，遠(yuǎn)端血管緩慢充盈；21 d 時(shí)血管完全再通，但血管仍明顯迂曲擴(kuò)張；單個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀測組的動(dòng)物模型，3 d 與7 d 時(shí)與連續(xù)觀測組模型表現(xiàn)情況大致相同；14 d 時(shí)部分動(dòng)物仍有靜脈充盈緩慢延后，血管迂曲變細(xì)現(xiàn)象，說明BRVO 模型維持穩(wěn)定；21 d 時(shí)光凝血管發(fā)生再通，可見血管有迂曲變細(xì)的形態(tài)變化。因此，兩個(gè)觀測分組FFA 的比較結(jié)果顯示：兩組動(dòng)物均造模成功，光凝血管阻塞程度表現(xiàn)大致相同，并且模型維持時(shí)間及血管再通時(shí)間也基本一致（圖2）。

圖2 FFA 檢測兔視網(wǎng)膜血管血流情況。2A 正常兔視網(wǎng)膜血管血流通常，熒光素均勻充盈；2B 造模后即時(shí)檢測光凝靜脈周圍出現(xiàn)熒光素滲漏；2C 造模后3 d 光凝點(diǎn)處有熒光素滲漏，滲漏區(qū)較前縮??；2D 造模后7d 血管迂曲變細(xì)，靜脈損傷部熒光素呈點(diǎn)狀滲漏；2E 造模后14d 血管仍為迂曲狀，損傷靜脈有熒光素著染；2F 造模后21 d 血管再通仍為迂曲形態(tài)，有側(cè)支循環(huán)建立

2.3 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)

圖3 模型兔視網(wǎng)膜組織HE 染色（×400）。3A 正常兔視網(wǎng)膜組織各層組織排列較整齊；3B 造模后7 d 可見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核及外核層水腫增厚；3C 造模后14 d 外核層細(xì)胞相對減少，剩3～4 層細(xì)胞；3D、3E 造模后21 d、28 d 視網(wǎng)膜基本恢復(fù)正常；3F 模型兔視網(wǎng)膜血管中可見血小板與紅細(xì)胞結(jié)合成的血栓組織，血管管壁完整

造模后實(shí)驗(yàn)兔視網(wǎng)膜整體結(jié)構(gòu)較紊亂，7 d 時(shí)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層嚴(yán)重水腫，內(nèi)核層和外核層也有輕度水腫；14 d 時(shí)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞明顯減少，外核層相對變?。?1 d 與28 d 視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常。部分血管可見少量血栓及纖維組織（圖3）。統(tǒng)計(jì)各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量與外核層細(xì)胞層數(shù)，發(fā)現(xiàn)在14 d 時(shí)模型兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)（2.83±1.17） 明顯少于正常兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)（12.33±8.07）個(gè)，t=2.480，P=0.020，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他時(shí)間點(diǎn)基本同正常組；14 d 時(shí)模型兔外核層細(xì)胞（4.00±1.27） 層少于正常對照組外核層細(xì)胞層數(shù)（5.83±0.75）層，t=4.166，P=0.000，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4），其他時(shí)間點(diǎn)較正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 兔視網(wǎng)膜組織中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)與外核層細(xì)胞層數(shù)變化。4A 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)（RGC/個(gè)）對比圖；4B 視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞層數(shù)（層）對比圖

3 討論

視網(wǎng)膜靜脈阻塞模型目前最常用的動(dòng)物有大鼠、有色兔與白兔等，大鼠由于眼球小，視網(wǎng)膜血管細(xì)，造成了光凝造模的技術(shù)難度；并有報(bào)道稱光凝后SD 大鼠死亡率高，約為20%～30%，眼球局部急性反應(yīng)耐受不良，可能與光凝所致的疼痛導(dǎo)致的心律失常有關(guān)；光凝血管再通時(shí)間約為3～5 d[3]，模型穩(wěn)定性差；兔子因?qū)嶒?yàn)成本低，眼球較大，視網(wǎng)膜動(dòng)、靜脈血管利于觀察，在RVO 研究中被大多數(shù)學(xué)者選為模型動(dòng)物，但兔眼的解剖結(jié)構(gòu)與人類有較大差異，尤其兩側(cè)視網(wǎng)膜靜脈走行與人體眼不一樣為直行，并不匯聚成靜脈血管弓，動(dòng)靜脈之間存在廣泛的動(dòng)靜脈交叉，并且在視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間存在一些毛細(xì)血管，因此這些解剖學(xué)差異使我們無法創(chuàng)造出與人類完全一致的BRVO 模型；當(dāng)前研究表明，色素含量不同的視網(wǎng)膜在接受光化學(xué)法造模后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定程度的差異，在眼底觀察方面，有色兔的RPE 層可見明顯的色素顆粒，故有色兔將更有利于對病程的掌握和觀察[5]。但目前使用白兔造模仍然較為普遍。

建立視網(wǎng)膜靜脈阻塞模型的方法有多種：光化學(xué)法、直接激光光凝法、光動(dòng)力誘導(dǎo)法、血管結(jié)扎、冷凝、凝血酶靜脈滴注法、玻璃體內(nèi)注入內(nèi)皮素-1 等[6]。其中直接激光光凝法及光動(dòng)力誘導(dǎo)法由于臨床效應(yīng)和精準(zhǔn)度問題應(yīng)用減少，而外科手術(shù)及凝血酶、內(nèi)皮素注射法由于造模成功率低未得到廣泛應(yīng)用[7]。1987年，Nanda 等[8]首先利用氙光燈激光加孟加拉紅成功制作兔BRVO 模型，這種方法被稱為光化學(xué)法，其原理是利用激光激發(fā)光敏劑后產(chǎn)生的熱效應(yīng)阻塞血管[9]。本實(shí)驗(yàn)中將熒光素鈉作為光敏物質(zhì)，它的激發(fā)光波長范圍為530～570 nm，本次實(shí)驗(yàn)使用的波長530 nm 正好將其激光吸收優(yōu)勢發(fā)揮到最佳。熒光素鈉注射后約有60%可與血紅蛋白結(jié)合，在造模過程中發(fā)揮了與孟加拉紅相同的功效，吸收光能后產(chǎn)生單態(tài)氧，可使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和細(xì)胞核酸過氧化，使細(xì)胞損傷。脂質(zhì)過氧化造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，激發(fā)血小板黏附和凝集，從而啟動(dòng)凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致血栓形成，因此光化學(xué)法建立的BRVO 模型，其血栓形成機(jī)制與臨床較相似[10-11]。然而，光化學(xué)法也有一定的缺點(diǎn)與局限性，例如臨床上激光作為BRVO 的一種常見治療方法，因此其作為造模方法并不能排除激光本身的治療作用[12]。同時(shí)由于激光的熱效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致光凝部位視網(wǎng)膜外核層的細(xì)胞損傷或凋亡，而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。再者，熒光素鈉等常見光敏劑極敏感，非常容易導(dǎo)致光凝的靜脈破裂出血，造成嚴(yán)重的玻璃體積血進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)觀察，因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本身的耐受性與敏感性選取合適的質(zhì)量濃度與注射劑量。最后，激光操作人員的激光技術(shù)和穩(wěn)定性以及輔助人員的穩(wěn)定性均會(huì)影響造模結(jié)果，因此，對團(tuán)隊(duì)的配合和協(xié)作有較高要求?？傊?，與以上其它方法相比，光化學(xué)法具有造模方法簡單，可批量制作，模型重復(fù)性好，成功率高，損傷精確可視化等優(yōu)點(diǎn)，并且光化學(xué)法建立的RVO 模型，其血栓形成機(jī)制與臨床更相似，所以光化學(xué)法用于建立BRVO 模型被廣泛認(rèn)可。隨著激光技術(shù)的進(jìn)步與光敏制劑研究的深入，光化學(xué)法造模操作技術(shù)不斷改進(jìn)，文獻(xiàn)中成功的新西蘭白兔RVO 模型的技術(shù)參數(shù)：光敏劑多選用孟加拉紅和熒光素鈉；倍頻532 型激光機(jī)，采用二極管激發(fā)式固態(tài)激光，波長為532 nm，能量設(shè)定為100～130 mW，光斑直徑對應(yīng)75 μm，持續(xù)時(shí)間0.2 s，照射點(diǎn)為10～18點(diǎn)[11]；還有能量設(shè)定為400 mW，光斑直徑為100 μm，持續(xù)時(shí)間為0.2 s，光凝點(diǎn)數(shù)為30 點(diǎn)[13]；倍頻ND：YAG激光機(jī)，采用氪-綠激光，波長為530 nm，能量設(shè)定為300 mW，光斑直徑為100 μm，持續(xù)時(shí)間0.2 s，光凝點(diǎn)數(shù)為60 點(diǎn)[4]等。不同的激光類型，具體參數(shù)也不同，需要在實(shí)驗(yàn)中調(diào)整，但結(jié)果均顯示造模成功。

關(guān)于光化學(xué)法制備BRVO 動(dòng)物模型的報(bào)道很多，但一直以來沒有標(biāo)準(zhǔn)的造模參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)成功建立了視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞的模型，現(xiàn)將該模型的優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)如下，優(yōu)點(diǎn)是，（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇：新西蘭白兔成本較低，眼球較大，可在眼底鏡下直接動(dòng)態(tài)觀察視網(wǎng)膜微循環(huán)的確切變化。雖然兔眼視網(wǎng)膜血管走行于視網(wǎng)膜有髓神經(jīng)纖維中，但不影響實(shí)驗(yàn)觀察和操作[14]。（2）光凝血管大小和位置的選擇：選擇兩側(cè)視網(wǎng)膜靜脈距離視盤0.5 DD 的分支靜脈處，此處血管清晰且粗細(xì)得當(dāng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)兔個(gè)體解剖結(jié)構(gòu)差異，光凝1～2 根分支靜脈，既保證了光凝過程中穩(wěn)定性問題，同時(shí)又能保證造模成功率。（3）光凝方法和光凝點(diǎn)數(shù)量的選擇：采用節(jié)段性光凝，先光凝選定部位的兩端，見靜脈收縮后再光凝中央，最終形成一段約1/3 DD 的靜脈阻塞區(qū)域，既避免光凝單點(diǎn)位置造成血管破裂出血，以及易損傷血管周圍視網(wǎng)膜等問題，又能通過增大血管阻塞部位及程度，有效地延長模型維持時(shí)間，提高造模成功率。（4）動(dòng)物分組：本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為連續(xù)觀測組與單個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀測組，得出的結(jié)果更豐富，減少了動(dòng)物個(gè)體差異的影響；同時(shí)能進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的病理學(xué)研究。從觀察結(jié)果看，14 d為本實(shí)驗(yàn)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)暨最可靠的靜脈血管阻塞維持時(shí)間點(diǎn)，為后期研究提供了基礎(chǔ)。（5）光敏劑的選擇：熒光素鈉與孟加拉紅相比，其不與組織牢固結(jié)合，不參與機(jī)體代謝，大部分經(jīng)腎臟隨尿液排出，毒性小，更安全[15]；同時(shí)可減少實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈炎的發(fā)生。（6）臨床符合性：臨床中視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞患者多合并高血壓病、糖尿病、高脂血癥等疾病，并且這些疾病本身作為BRVO 的危險(xiǎn)因素，參與了其發(fā)病過程，因此建立合并相關(guān)疾病的光化學(xué)兔BRVO 模型，更能接近臨床實(shí)踐。實(shí)驗(yàn)中的問題與不足：（1）由于白兔眼底視盤界限模糊，顏色較暗，眼底彩照無法拍攝滿意的效果，今后應(yīng)注意選用適合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼底彩照的專業(yè)儀器；（2）由于預(yù)實(shí)驗(yàn)中單純激光光凝血管再通快，模型難以維持，故優(yōu)化造模方法加用熒光素鈉光敏劑，在后期實(shí)驗(yàn)中可設(shè)置激光光凝組作為對照以使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更完整；（3） 目前的BRVO 模型還不能完全模擬人類視網(wǎng)膜靜脈阻塞的發(fā)病機(jī)制及病理改變，研究者應(yīng)根據(jù)研究目的選擇不同的BRVO 模型才能保證研究的科學(xué)性[16]。

綜上所述，通過選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，恰當(dāng)?shù)募す忸愋汀⒛芰亢凸饽龝r(shí)間，合理的光凝位置，比較適宜的光敏劑等，可以成功模擬BRVO 的臨床病理過程，成功建立新西蘭兔BRVO 模型，該造模方法切實(shí)可行、重復(fù)性好、成功率高?？梢罁?jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康母倪M(jìn)細(xì)節(jié)以期模擬出更長期穩(wěn)定、更符合臨床實(shí)際的BRVO 模型。