張園園，張平平，王春娥，趙愛華，楊瑞馥，魏東

·論著·

布魯氏菌抗原檢測試劑用國家參考品的研制

張園園*，張平平*，王春娥，趙愛華，楊瑞馥，魏東

102629 北京，中國食品藥品檢定研究院衛(wèi)生部生物技術(shù)檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（張園園、王春娥、趙愛華、魏東）；100071 北京，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（張平平、楊瑞馥）

研制布魯氏菌抗原檢測試劑評(píng)價(jià)用國家參考品。

將 3 株布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株和 10 株陰性參考菌株在各自適宜的培養(yǎng)基和溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，收集新鮮培養(yǎng)物并滅活，采用比濁法制備陽性和陰性參考品菌液；分光光度法制備最低檢出量和重復(fù)性參考品菌液。對(duì)參考品進(jìn)行均勻性檢測和穩(wěn)定性試驗(yàn)，組織 4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)布魯氏菌抗原檢測試劑用參考品進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定。

建立了由 3 株布魯氏菌為陽性參考品、10 株陰性菌為陰性參考品、最低檢出量參考品及重復(fù)性參考品組成的布魯氏菌抗原檢測試劑評(píng)價(jià)用國家參考品。該參考品具有較好的均勻性及穩(wěn)定性。協(xié)作標(biāo)定結(jié)果為陽性參考品符合率均為 100%，陰性參考品符合率均為 90%，最低檢出量參考品的檢出限為 1 × 107~ 1 × 106個(gè)/ml 之間，重復(fù)性參考品均符合規(guī)定。

研制的布魯氏菌抗原檢測試劑評(píng)價(jià)用國家參考品可用于布魯氏菌抗原檢測試劑的質(zhì)量控制。

布魯氏菌；抗原； 國家參考品； 均勻性； 穩(wěn)定性

布魯氏菌?。ê喎Q布?。┦怯刹剪斒暇ê喎Q布氏菌）引起的一類人畜共患疾病，是《中華人民共和國傳染病防治法》中規(guī)定報(bào)告的乙類傳染病。布病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是全球特別是發(fā)展中國家面臨的主要公共衛(wèi)生問題[1-2]。布病可通過口腔黏膜、鼻腔、眼結(jié)膜、生殖道，甚至未損傷的皮膚感染[3]。布病不僅影響畜牧業(yè)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，造成社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失，還對(duì)人類的健康構(gòu)成重大威脅[4]，美國疾病預(yù)防控制中心將布氏菌列為潛在的生物恐怖戰(zhàn)劑[5-6]。我國是布病的歷史疫區(qū)，近年來布病流行較為嚴(yán)重，且發(fā)病率逐年遞增，2018 年發(fā)病率為 2.73/10 萬，已經(jīng)連續(xù)十年年發(fā)病人數(shù)超過 3 萬。

布魯氏菌抗原檢測是疾病診斷中重要的實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目，而我國尚無布魯氏菌抗原檢測試劑評(píng)價(jià)用國家參考品。為此，我們研制了布魯氏菌抗原檢測試劑評(píng)價(jià)用參考品，其對(duì)于布魯氏菌抗原檢測試劑的注冊(cè)管理、指導(dǎo)我國該類試劑的健康有序發(fā)展，均具有重要意義?，F(xiàn)將布魯氏菌抗原檢測試劑評(píng)價(jià)用參考品研制情況報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌種 牛種布氏菌 104M 株（CMCC55010）、豬種布氏菌 S2 株（CMCC55007）、羊種布氏菌 M5 株（CMCC55009）、大腸埃希菌（CMCC44113）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:3 血清型（CMCC52203）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:8 血清型（CMCC52211）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:9 血清型（CMCC52212）、土拉熱弗朗西絲菌 LVS 株、鼠疫耶爾森菌（CMCC52006）、炭疽芽孢桿菌（CMCC63001）、霍亂弧菌（CMCC18001）、傷寒沙門菌（CMCC50071）、志賀氏菌（CMCC51105）均由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC）提供。

1.1.2 試劑 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基均購自美國 BD 公司；中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)國家標(biāo)準(zhǔn)品及皮上劃痕用鼠疫、布氏、炭疽活疫苗菌濃度測定通用參考品均由我院制備；布魯氏菌上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測試劑（批號(hào)：20190601）由北京熱景生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；布魯氏菌抗原檢測試劑（膠體金法）（批號(hào)：20190101801）由北京金豪制藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 生物安全柜購自美國 Nuaire 公司；MIR-153 型恒溫培養(yǎng)箱購自日本三洋公司；UV-2401 型紫外可見分光光度計(jì)購自日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 不同滅活方式及保存溫度對(duì)布氏菌抗原性影響 將新鮮制備的布氏菌液（CMCC55010）分別經(jīng) 70 ℃滅活 1 h 和 1% 甲醛溶液滅活，每種滅活菌液分別稀釋成1.0 × 108個(gè)/ml，分別放置 4 ℃、–20 ℃及–80 ℃保存，1 個(gè)月后將菌液稀釋成 1.0 × 107個(gè)/ml 進(jìn)行抗原性檢測。

1.2.2 菌液的制備

1.2.2.1 陽性參考品菌液制備 將布氏菌株接種 TSA 平皿，35 ~ 37 ℃培養(yǎng) 44 ~ 48 h 后收獲。將收獲菌液用中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)國家標(biāo)準(zhǔn)品測定濃度后稀釋成 1.0 × 1010個(gè)/ml，70 ℃滅活1 h。經(jīng)滅活驗(yàn)證合格后分裝，–80 ℃保存。

1.2.2.2 陰性參考品菌液制備 將菌株接種于各自適宜生長的培養(yǎng)基上，并于最適溫度下進(jìn)行培養(yǎng)后收獲。將收獲菌液用中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)國家標(biāo)準(zhǔn)品測定濃度后稀釋成 1.0 × 1010個(gè)/ml，經(jīng)適當(dāng)方式滅活。經(jīng)滅活驗(yàn)證合格后分裝，–80 ℃保存。

1.2.2.3 最低檢出量和重復(fù)性參考品菌液的制備 將布氏菌株（CMCC55010）接種 TSA 平皿，35 ~ 37 ℃培養(yǎng) 44 ~ 48 h 后收獲。將收獲菌液經(jīng)分光光度法測定濃度后稀釋成 1.0 × 1010個(gè)/ml，70 ℃滅活 1 h。經(jīng)滅活驗(yàn)證合格后分裝，–80 ℃保存。

1.2.3 參考品的制備

1.2.3.1 陽性參考品的制備 將 3 株布氏菌原始菌液以生理鹽水稀釋至 1.0 × 108個(gè)/ml 濃度，定量分裝，0.5 ml/管，–20 ℃以下保存，分別編號(hào)為 P1 ~ P3。

1.2.3.2 陰性參考品的制備 將 10 株陰性菌的原始菌液以生理鹽水稀釋至 1.0 × 108個(gè)/ml濃度，定量分裝，0.5 ml/管，–20 ℃以下保存，分別編號(hào)為 N1 ~ N10。

1.2.3.3 最低檢出量及重復(fù)性參考品的制備 將布氏菌原始菌液（CMCC55010）用凍干保護(hù)劑稀釋至 1.0 × 108個(gè)/ml，定量分裝，0.5 ml/支，凍干后封口，–20 ℃以下保存。分裝精確度不高于 1%，水分不高于 3.0%。

1.2.4 均勻性檢測 隨機(jī)抽取凍干的最低檢出量參考品 10 支，分別加入 0.5 ml 生理鹽水復(fù)溶，稀釋到 2.5 × 107個(gè)/ml。用布魯氏菌上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測試劑進(jìn)行檢測，每支樣品重復(fù)測定 3 次，將測定值進(jìn)行單因子方差分析。

1.2.5 參考品的穩(wěn)定性研究

1.2.5.1 凍融穩(wěn)定性試驗(yàn) 從–20 ℃冰箱中取出最低檢出量參考品、陽性參考品及陰性參考品中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:9 血清型菌株，于室溫放置約 8 h，再放回 –20 ℃冰箱。按此步驟重復(fù) 1 次或 3 次。將所有樣品再次從–20 ℃冰箱中取出，平衡至室溫后，用檢測試劑進(jìn)行檢測。

1.2.5.2 加速穩(wěn)定性試驗(yàn) 從–20 ℃冰箱中取出最低檢出量參考品、陽性參考品及陰性參考品中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:9 血清型菌株，分別于 4、25、37 ℃各放置 2 套，3 d 和5 d 后各取出 1 套，用檢測試劑進(jìn)行檢測。

1.2.5.3 長期穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)最低檢出量參考品進(jìn)行了長期穩(wěn)定性研究，現(xiàn)已完成 1 個(gè)月、3 個(gè)月、6 個(gè)月檢測。

1.2.6 參考品協(xié)作標(biāo)定 2 家生產(chǎn)單位使用各自生產(chǎn)的試劑進(jìn)行檢測，中國食品藥品檢定研究院檢驗(yàn)人員（未參與樣品編盲）使用布魯氏菌抗原檢測試劑（膠體金法）進(jìn)行檢測，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所使用布魯氏菌上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測試劑進(jìn)行檢測。4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室編號(hào)分別為 1、2、3、4。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件，將測定結(jié)果進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以< 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同滅活方式及保存溫度對(duì)布氏菌抗原性影響

抗原性檢測結(jié)果見表 1。熱滅活方式對(duì)抗原性影響明顯小于甲醛滅活，4 ℃保存樣品抗原性不穩(wěn)定，–20 ℃及–80 ℃保存抗原穩(wěn)定性較好且未見明顯差異。最終確定布氏菌滅活方式為 70 ℃ 1 h，保存條件為–20 ℃。

2.2 均勻性檢測

結(jié)果見表 2。臨界值0.05（9，20）= 2.42，計(jì)算的值為 2.229，該值<臨界值，= 0.065 > 0.05，這表明在 0.05 顯著性水平時(shí)，樣品中的抗原量是均勻的。

表 1 不同滅活方式及保存溫度對(duì)布氏菌體抗原性影響（T/C）

表 2 均勻性檢查結(jié)果（T/C）

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.1 凍融穩(wěn)定性試驗(yàn) 凍融 1 次及 3 次后最低檢出量參考品的檢出限度與未凍融對(duì)照無差別，結(jié)果見表 3。3 株陽性參考品及陰性參考品中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:9 血清型菌株凍融 1 次及 3 次后仍均為陽性。研究結(jié)果表明最低檢出量參考品、陽性參考品及陰性參考品中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:9 血清型菌株具有較好的凍融穩(wěn)定性。

2.3.2 加速穩(wěn)定性試驗(yàn) 所有加速試驗(yàn)后最低檢出量參考品的檢出限度與–20 ℃保存的對(duì)照樣品無差別，結(jié)果見表 4。3 株陽性參考品及陰性參考品中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:9血清型菌株加速試驗(yàn)后仍均為陽性。研究結(jié)果表明最低檢出量參考品、陽性參考品及陰性參考品中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:9 血清型菌株具有較好的加速穩(wěn)定性。

2.3.3 長期穩(wěn)定性試驗(yàn) 觀察期內(nèi)最低檢出量參考品的最低檢出限度未見變化，結(jié)果見表 5，表明最低檢出量參考品具有較好的長期穩(wěn)定性。

2.4 協(xié)作標(biāo)定

4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室的陽性參考品符合率均為 100%。4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室的陰性參考品符合率均為 90%，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:9 血清型菌株均出現(xiàn)了假陽性。最低檢出量參考品方面，1 家企業(yè)試劑的最低檢出量為 1 × 106個(gè)/ml，另 1 家試劑的最低檢出量為 1 × 107個(gè)/ml。重復(fù)性參考品方面，兩家企業(yè)試劑均檢測為陽性，且平行檢測 10 次，顯色度均一或 CV 值小于 10%，結(jié)果見表 6。

表 3 最低檢出量參考品凍融試驗(yàn)結(jié)果

表 4 最低檢出量參考品加速試驗(yàn)結(jié)果

表 5 長期定性試驗(yàn)結(jié)果

表 6 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

3 討論

在世界范圍內(nèi)，引起人類布病的主要是羊種、牛種和豬種布氏菌[7-8]。所以，本套參考品中的陽性參考品分別設(shè)置了羊種、牛種和豬種布氏菌。陰性參考品包括與布氏菌感染癥狀相近的菌株，也包括了文獻(xiàn)報(bào)道與布氏菌有交叉的菌株，如霍亂弧菌、土拉熱弗朗西絲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:9 血清型菌株等[9-10]。

在陰性參考品的篩選過程中發(fā)現(xiàn)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:9 血清型菌株與布氏菌存在明顯的抗原交叉。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果的可靠性，我們將小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:9 血清型菌株進(jìn)行了單克隆化，隨機(jī)選取 3 個(gè)單克隆菌落，進(jìn)行了抗原性檢測及 16S rDNA 測序，結(jié)果表明單克隆菌落為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，3 個(gè)單克隆菌落經(jīng)布魯氏菌抗原檢測試劑檢測均為陽性。該結(jié)果表明現(xiàn)有檢測方法尚無法鑒別布氏菌與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O:9 血清型菌株。

最低檢出量參考品是評(píng)價(jià)產(chǎn)品檢測能力的最重要工具[11]。對(duì)于診斷產(chǎn)品，最低檢出量參考品是評(píng)價(jià)產(chǎn)品檢測下限的依據(jù)，其穩(wěn)定性對(duì)于檢測試劑的質(zhì)量控制非常重要。為保證參考品的穩(wěn)定性，我們對(duì)最低檢出量參考品進(jìn)行了凍干處理，研究結(jié)果表明該參考品具有較好的穩(wěn)定性。

本研究所建立的布魯氏菌抗原檢測試劑評(píng)價(jià)用參考品，可用于布魯氏菌抗原檢測試劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)，對(duì)于提高產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。

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Preparation of national reference for detection reagentantigen

ZHANG Yuan-yuan, ZHANG Ping-ping, WANG Chun-e, ZHAO Ai-hua, YANG Rui-fu, WEI Dong

Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products, National Institute for Food and Drug Control, Beijing 102629, China (ZHANG Yuan-yuan, WANG Chun-e, ZHAO Ai-hua, WEI Dong); State Key Laboratory of Pathogens and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences, Beijing 100071, China (ZHANG Ping-ping, YANG Rui-fu)

To prepare national reference for detection reagent ofantigen.

Three standard strains ofand ten reference strains of non-were cultured in appropriate culture media at appropriate temperatures respectively. Fresh and uncontained cultures were collected, based on which positive and negative reference bacterial liquids were prepared by turbidimetry, and the reference bacterial liquids for minimum detection limit and repeatability were prepared by spectrophotometry. The prepared references were subjected to uniformity and stability test. Four laboratories were organized to coordinate the calibration of reference materials.

Positive reference consisted of three samples ofliquids, while negative reference consisted of ten samples of non-liquids. The reference for minimum detection and reproducibility consisted of frozen dried bacteria. The reference had good uniformity and stability. The collaborative calibration results of four laboratories showed that three positive references were 100% positive, ten negative references were 90% negative, and the lowest detection amount was between 107cells/ml and 106cells/ml. Repetitive reference test results were found to be consistent.

The reference can be used for quality control ofantigen detection reagent.

; Antigen; National reference; Uniformity; Stability

WEI Dong, Email: weidong1994@sina.com; YANG Rui-fu, Email: 13801034560@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.03.006

國家科技重大專項(xiàng)（2018ZX10102-001）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC200500）

魏東，Email：weidong1994@sina.com；楊瑞馥，Email：13801034560@163.com

2019-11-04

*同為第一作者