何劉軍，謝永麗，岑山，周金明

·論著·

以KRAS為靶標(biāo)的抗結(jié)腸癌藥物篩選系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用

何劉軍，謝永麗，岑山，周金明

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫生物學(xué)室（何劉軍、謝永麗、岑山、周金明）；321004 金華，浙江師范大學(xué)生化學(xué)院現(xiàn)代制藥創(chuàng)新研究中心（謝永麗、周金明）

構(gòu)建以 KRAS 為靶標(biāo)的抗結(jié)腸癌藥物篩選系統(tǒng)，為抗結(jié)腸癌藥物篩選提供新的技術(shù)手段。

首先選取細(xì)胞系并確定系統(tǒng)的技術(shù)參數(shù)，構(gòu)建以 KRAS 為靶標(biāo)的抗結(jié)腸癌藥物篩選系統(tǒng)，設(shè)計實驗驗證篩選系統(tǒng)的有效性；而后將構(gòu)建的篩選系統(tǒng)初步應(yīng)用，篩選化合物庫 Z183593-L1200，并對篩選結(jié)果進(jìn)行驗證，驗證篩選系統(tǒng)的可行性。

完成篩選系統(tǒng)構(gòu)建后，通過篩選系統(tǒng)（in-cell Western blot）測得的 Hce8693 和 T47D 細(xì)胞的 KRAS 表達(dá)差異與普通 Western blot 一致，篩選系統(tǒng)測定的 siRNA 系統(tǒng)的敲低效率與普通 Western blot 亦一致，篩選系統(tǒng)的有效性得到初步驗證。篩選激酶抑制劑化合物庫 Z183593-L1200 后，選取活性最好的化合物 PF-04691502 進(jìn)行驗證；濃度梯度實驗顯示，隨著 PF-04691502 濃度升高則 KRAS 胞內(nèi)含量降低，KRAS 胞內(nèi)含量對 PF-04691502 濃度呈梯度依賴性；細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示 PF-04691502 對 Hce8693 細(xì)胞的半數(shù)有效濃度（IC50）為 3.546 μmol/L，進(jìn)一步驗證了系統(tǒng)的可行性。

所構(gòu)建的以 KRAS 為靶標(biāo)的抗結(jié)腸癌藥物篩選系統(tǒng)具有一定有效性和可行性，能夠用于以 KRAS 蛋白為藥物靶點的藥物高通量篩選，為抗結(jié)腸癌的藥物研發(fā)提供了新的篩選方法。

高通量模型； 結(jié)腸癌； KRAS； 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)

是一種原癌基因，長約 35 kb，位于12 號染色體，是基因（及）家族成員之一[1]?；罨谋砥どL因子受體（EGFR）蛋白通過募集生長因子受體結(jié)合蛋白 2（GRB2）結(jié)合鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEF）促進(jìn) KRAS 蛋白的核苷酸交換，使其轉(zhuǎn)化為活性 GTP 結(jié)合態(tài)?；罨?KRAS 會激活一系列的下游通路，尤其是 RAF/MEK/ERK 和 PI3K/AKT 通路，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖和抑制細(xì)胞凋亡[2-3]?；虻募せ钔蛔兛梢种?KRAS 蛋白的 GTPase 酶活性，和野生型 KRAS 蛋白相比降低 GTP 水解活性 3 ~ 9 倍[4]，促使 KRAS 蛋白處于 GTP 結(jié)合活性構(gòu)象，導(dǎo)致 KRAS 信號處于持續(xù)激活狀態(tài)，進(jìn)而引起細(xì)胞增殖失控，導(dǎo)致癌變發(fā)生[5-6]，基因突變在腫瘤中廣泛存在，在胰腺導(dǎo)管腺癌、結(jié)直腸腺癌、肺腺癌等腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)[7]，是重要的癌癥驅(qū)動基因[8-9]；在 30% ~ 40%結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)具有激活基因突變。使用等位基因敲除和敲入野生型或激活突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞系研究表明，這些突變在腫瘤細(xì)胞生存和腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。突變可增強(qiáng)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，改變細(xì)胞代謝和腫瘤微環(huán)境[1, 6]。上述研究表明，降低 KRAS 的胞內(nèi)含量能達(dá)到抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長和增殖的目的，將降低 KRAS 蛋白的胞內(nèi)含量作為抗結(jié)腸癌藥物的研發(fā)策略具有可行性。

近紅外雙色激光成像系統(tǒng)（in-cell Western blot）在細(xì)胞內(nèi)即可完成胞內(nèi)蛋白含量測定，操作簡便，定量線性范圍廣，且適用于高通量篩選，相較于傳統(tǒng)的 Western blot 實驗具有突出的優(yōu)勢；本研究旨在以 KRAS 蛋白的胞內(nèi)含量作為篩選指標(biāo)，以近紅外雙色激光成像系統(tǒng)為技術(shù)手段建立一個以 KRAS 為靶標(biāo)的抗結(jié)腸癌藥物篩選系統(tǒng)，以便能夠從數(shù)量巨大的化合物實體庫中精準(zhǔn)高效地獲得抗結(jié)腸癌的活性化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 Costar 低熒光 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板為美國 Corning 公司產(chǎn)品；鼠源抗 KRAS 抗體為中國臺灣Abnova 公司產(chǎn)品；兔源抗 β-Actin 抗體為武漢愛博泰克生物科技有限公司產(chǎn)品；IRDye800 cw 抗鼠熒光二抗和 IRDye800 cw 抗兔熒光二抗為美國LI-COR 公司產(chǎn)品；RPM1640 培養(yǎng)基、0.25% 胰蛋白酶、25 ml 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6 孔及 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、Lipofectamine RNAiMAX Reagent 和 1 × PBS 緩沖液均為美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；Hce8693 人盲腸腺癌細(xì)胞為廣州華拓生物科技有限公司產(chǎn)品；T47D 人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞為美國ATCC 產(chǎn)品；RIPA 裂解液（強(qiáng)）和Cell counting kit8（CCK8）為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；si-h-KRAS siRNA 敲低系統(tǒng)為廣州博銳生物科技有限公司產(chǎn)品；化合物庫 Z183593-L1200 為美國 Selleck Chemicals 公司產(chǎn)品；其他無機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實驗儀器 Odyssay 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)為美國 LI-COR 公司產(chǎn)品；平臥式搖床為海門其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；電泳轉(zhuǎn)膜儀為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；生物潔凈工作臺為北京泰奇凈設(shè)備有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；干式恒溫器為杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品；EnSpire 2300 多功能酶標(biāo)儀為美國PerkinElmer 公司產(chǎn)品；自動細(xì)胞計數(shù)儀為美國Countstar BioTech 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將細(xì)胞用 1 ml 0.25% 胰蛋白酶消化 2 min，用 4 ml RPM1640 終止消化，首先按 1:5 傳至新的 25 ml 培養(yǎng)瓶；而后使用自動細(xì)胞計數(shù)儀測定細(xì)胞濃度，將細(xì)胞懸液稀釋成2 × 105/ml，混勻后，將細(xì)胞懸液加入96 孔板中，200 μl/孔（每孔細(xì)胞數(shù) 4 × 104個），勿劇烈晃動，與 25 ml 培養(yǎng)瓶一同放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 37 ℃、5% CO2。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按每孔 100 μl 吸取無血清的 RPM1640 培養(yǎng)基至 1.5 ml 離心管 A，加入RNAiMAX Reagent 5 μl/孔，另取與轉(zhuǎn)染孔數(shù)量相等的 1.5 ml 離心管，每孔加入 100 μl 無血清的 RPM1640 培養(yǎng)基，以及 5 μl 的 siRNA，靜置5 min，然后將離心管中的混合液按 105 μl/管加入到已加入 siRNA 的離心管中，靜置 15 min，然后全部加入至 6 孔板中。

1.2.3 蛋白提取 將培養(yǎng)基吸出，用 1 × PBS 洗一遍，加入 RIPA 裂解液，冰上放置 20 min，加入5 × protein loading buffer，然后干式恒溫器，100 ℃加熱30 min，然后將樣品置于–20 ℃貯存。

1.2.4 Western blot 將樣品取出，組裝電泳裝置，加入蛋白樣品，10 μl/孔，進(jìn)行電泳操作（S1：75 V，45 min；S2：110 V，45 min），電泳完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（75 V，75 min），再用 5% 脫脂牛奶封閉1 h，1 × PBST 洗兩次，而后進(jìn)行一抗孵育（鼠源抗 KRAS 抗體 1:2000 稀釋；兔源抗 β-Actin 抗體 1:2000 稀釋），4 ℃過夜孵育；1 × PBST 洗4 次，5 min/次；孵育二抗（IRDye800 cw 抗鼠熒光二抗 1:500 稀釋；IRDye800 cw 抗兔熒光二抗 1:500 稀釋），室溫孵育 1 h；1 × PBST 洗 4 次，5 min/次；利用 Odyssay 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃描。

1.2.5 In-cell Western blot 將已長滿細(xì)胞的 Costar 低熒光 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，加入 3.7% 的甲醛溶液，100 μl/孔，固定 25 min；而后加入 0.1% 的 Triton-X100 溶液，100 μl/孔，打孔 20 min；加入 0.1% FBS，100 μl/孔，封閉 1 h；用 1 × PBS 洗滌 2 次，5 min/次；孵育一抗（鼠源抗 KRAS 抗體 1:400 稀釋；兔源抗 β-Actin 抗體 1:1000 稀釋），4 ℃過夜孵育；1 × PBS 洗 4 次，5 min/次；孵育二抗（IRDye800 cw 抗鼠熒光二抗 1:500 稀釋；IRDye680 cw 抗兔熒光二抗 1:500 稀釋），室溫孵育 1 h；1 × PBS 洗 4 次，5 min/次；利用 Odyssay 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃描。

1.2.6 IC50的測定及計算 將細(xì)胞傳代至 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，4 × 104/孔，24 h 后加入梯度稀釋的待測化合物在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后，加入 CCK8，10 μl/孔，然后細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置 2 h，使用 EnSpire 2300 多功能酶標(biāo)儀在波長 450 nm 處測量吸光度（450），而后將數(shù)據(jù)導(dǎo)出，進(jìn)行初步處理。將濃度按照從小到大順序排列，實驗組吸光度除以對照組并換算成百分比；而后在 Graphpad prism 5.0 上作散點圖，橫軸為化合物濃度，縱軸為實驗組450數(shù)值與 DMSO 組比值的百分?jǐn)?shù)，而后計算 IC50。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建以 KRAS 為靶標(biāo)的抗結(jié)腸癌藥物篩選系統(tǒng)

2.1.1 確定藥物篩選系統(tǒng)的細(xì)胞系 基于實驗室現(xiàn)有的近紅外雙色激光成像系統(tǒng)，選取人結(jié)腸癌的一個細(xì)胞系Hce8693，其基因發(fā)生突變，同時在胞內(nèi)呈高表達(dá)，且抑制 Hce8693 細(xì)胞胞內(nèi)的 KRAS 含量能夠抑制細(xì)胞增殖[10]，細(xì)胞大小適中，貼壁生長，適用于近紅外雙色激光成像系統(tǒng)。

2.1.2 制定藥物篩選系統(tǒng)的大體流程 將 Hce8693 細(xì)胞傳代至 Costar 低熒光 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，然后每孔加入待篩選化合物（1 μmol/L），設(shè)置 1 個復(fù)孔，培養(yǎng) 24 h；經(jīng)前處理后，通過近紅外雙色熒光報告系統(tǒng)檢測細(xì)胞胞內(nèi)的KRAS 蛋白含量，而后對實驗結(jié)果進(jìn)行驗證。

2.2 驗證以 KRAS 為靶標(biāo)的抗結(jié)腸癌藥物篩選系統(tǒng)的有效性

2.2.1 利用不同細(xì)胞系間 KRAS 蛋白表達(dá)差異驗證篩選系統(tǒng)的有效性 由于目前沒有以降低 KRAS 蛋白胞內(nèi)含量為研發(fā)策略的陽性藥，為了驗證篩選系統(tǒng)的可靠性，我們選取了人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞 T47D 作為對照細(xì)胞，其相對低表達(dá) KRAS[7]。首先，普通 Western blot實驗（圖 1A）及半定量分析（圖 1B）證明了 T47D 細(xì)胞相較于 Hce8693 細(xì)胞顯著低表達(dá) KRAS，KRAS 蛋白胞內(nèi)含量僅為 Hce8693 的 26%；篩選系統(tǒng)（in-cell Western blot）半定量分析結(jié)果（圖 1C、1D）表明，T47D 胞內(nèi)的 KRAS 蛋白水平顯著低于 Hce8693 細(xì)胞，相當(dāng)于 Hce8693 胞內(nèi)的 23%。綜上所述，篩選系統(tǒng)的結(jié)果與普通 Western blot 實驗結(jié)果基本一致，表明篩選系統(tǒng)能夠較為準(zhǔn)確地檢測 KRAS 在胞內(nèi)含量的差異，鑒于傳統(tǒng) Western blot 實驗的可信度，能夠初步驗證篩選系統(tǒng)的有效性。

2.2.2 siRNA 敲低系統(tǒng)驗證系統(tǒng)有效性 為了驗證篩選系統(tǒng)的有效性，我們構(gòu)建了 KRAS 的 siRNA 系統(tǒng)（si-h-KRAS-1/2/3），首先借助于普通 Western blot 驗證 3 種 siRNA 的敲低效率（圖 2A），分析結(jié)果表明，si-h-KRAS-1 和 si-h-KRAS-3 的敲低效率較高，敲低效率分別為 65% 和 63%（圖 2B）；而后使用篩選系統(tǒng)檢測 si-h-KRAS-1 和 si-h-KRAS-3 的敲低效率（圖 2C），定量后的結(jié)果顯示，si-h-KRAS-1 和 si-h-KRAS-3 的敲低效率分別為 71% 和 58%（圖 2D）。綜上結(jié)果，普通Western blot 結(jié)果與篩選系統(tǒng)的驗證結(jié)果基本一致，篩選系統(tǒng)的有效性得到了進(jìn)一步驗證。

圖 1 兩株 KRAS 差異表達(dá)的細(xì)胞驗證篩選系統(tǒng)有效性（A：普通 Western blot實驗結(jié)果；B：普通 Western blot 實驗蛋白定量；C：篩選系統(tǒng)實驗結(jié)果；D：篩選系統(tǒng)蛋白定量）

Figure 1 Verifying the availability of the screening system by two strains of KRAS differentially expressed cells (A: Results of general Western blot experiment; B: Protein quantification of general Western blot experiment; C: Experimental results of screening system; D: Protein quantitative map of screening system)

圖 2 構(gòu)建siRNA 敲低系統(tǒng)驗證篩選系統(tǒng)的有效性（A：普通Western blot 實驗結(jié)果；B：普通Western blot 實驗蛋白定量；C：篩選系統(tǒng)實驗結(jié)果；D：篩選系統(tǒng)蛋白定量）

Figure 2 Establishing siRNA system to verify the availability of the screening system (A: General Western blot experimental results chart; B: Ordinary Western blot experimental protein quantification chart; C: Screening system experimental results graph; D: Screening system protein quantification graph)

2.3 篩選化合物庫驗證以 KRAS 為靶標(biāo)的抗結(jié)腸癌藥物篩選系統(tǒng)的可行性

為進(jìn)一步驗證以 KRAS 為靶標(biāo)的抗結(jié)腸癌藥物篩選系統(tǒng)的可行性，利用篩選系統(tǒng)對激酶抑制劑化合物庫Z183593-L1200 中的 425 個化合物進(jìn)行高通量篩選（圖 3），并選取降低 Hce8693 細(xì)胞胞內(nèi) KRAS 蛋白含量最為明顯的化合物 PF-04691502（KRAS 蛋白胞內(nèi)含量抑制率 64%）（圖 4A）進(jìn)行活性驗證并測定其 IC50。濃度梯度實驗結(jié)果顯示，隨著化合物 PF-04691502 濃度的提高，KRAS 的胞內(nèi)含量不斷降低，與 PF-04691502呈濃度依賴關(guān)系（圖 4B、4C）。雖然在 PF-04691502 濃度為 1 μmol/L 時，對 KRAS 蛋白胞內(nèi)含量抑制率僅為 43%，和初篩數(shù)據(jù)不相符，但仍表明PF-04691502 的篩選結(jié)果可信度較高；細(xì)胞增殖實驗結(jié)果經(jīng) Graphpad prism 5.0 作圖并計算而知，化合物 PF-04691502 對細(xì)胞 Hce8693 的 IC50為 3.546 μmol/L（圖4D）。以上實驗結(jié)果反映出化合物 PF-04691502 能有效降低 Hce8693 胞內(nèi)KRAS蛋白含量，并能夠抑制細(xì)胞的生長和增殖；表明篩選系統(tǒng)可從化合物庫中篩選出降低結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi) KRAS 蛋白含量的活性化合物，篩選系統(tǒng)的可行性得到驗證。

圖 3 激酶抑制劑庫 LP1200 的篩選結(jié)果

Figure 3 Screening results of the kinase inhibitor library LP1200

3 討論

KRAS 在結(jié)腸癌等癌癥發(fā)生發(fā)展過程中是重要的驅(qū)動基因，目前以 KRAS 作為藥物靶標(biāo)的研發(fā)策略主要包括：①減少 KRAS-GTP 的含量；②阻礙 KRAS-GTP 與下游效應(yīng)因子的結(jié)合；③減少 KRAS-GTP 的膜錨定；④減少 KRAS-GTP 的二聚化和多聚化[11]。相比于上述四種研發(fā)策略，降低 KRAS 蛋白胞內(nèi)含量這種研發(fā)策略成本最低，且研究人員進(jìn)行了多次原理性驗證。Singh 等[12]采用shRNA 敲除研究表達(dá) KRAS 蛋白的細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞系分為兩類，KRAS 依賴組和 KRAS 非依賴組。KRAS 依賴組細(xì)胞系表達(dá) E-cadherin 因子，對敲低 KRAS 蛋白的 shRNA 敏感。同時，多西環(huán)素誘導(dǎo) KRAS 蛋白表達(dá)在小鼠實驗表明，誘導(dǎo)表達(dá) KRAS 蛋白可以形成腫瘤，而停止誘導(dǎo)表達(dá) KRAS 蛋白會使腫瘤變小并消失[13]。以降低 KRAS 蛋白胞內(nèi)含量作為研究策略，阿斯利康開發(fā)了反義核苷酸 AZD4785。AZD4785 可有效抑制細(xì)胞中的 mRNA 和蛋白的表達(dá)，可選擇性抑制突變介導(dǎo)的下游因子通路以及突變細(xì)胞的增殖。小鼠體內(nèi)實驗也證實 AZD4785 可以抑制 KRAS 突變細(xì)胞移植腫瘤以及患者來源移植腫瘤中的 KRAS 表達(dá)，抑制其腫瘤的生長。同時以小鼠和猴子為評價模型表明 AZD4785 可在一系列的組織中穩(wěn)定下調(diào)目標(biāo)蛋白 KRAS 的水平，并未表現(xiàn)任何副作用[14]。這些研究結(jié)果充分表明降低 KRAS 胞內(nèi)含量在體內(nèi)外均具較好的抑癌效果及安全性，更進(jìn)一步佐證了以降低KRAS 的胞內(nèi)含量為研發(fā)策略的可行性。

圖 4 驗證化合物 PF-04691502 對 Hce8693 的抑制活性（A：化合物 PF-04691502 的化學(xué)結(jié)構(gòu)；B：普通 Western blot 實驗結(jié)果；C：普通 Western blot 實驗蛋白定量；D：細(xì)胞增殖實驗結(jié)果）

Figure 4 Verifying the inhibitory activity of compound PF-04691502 on Hce8693 (A: Chemical structure of compound PF-04691502; B: Normal Western blot results; C: Normal Western blot experimental protein quantitative map; D: Results ofcell proliferation test)

本研究初步建立以 KRAS 為靶標(biāo)的抗結(jié)腸癌藥物篩選系統(tǒng)，通過設(shè)置陰性對照細(xì)胞和敲低胞內(nèi) KRAS 的方法驗證系統(tǒng)的有效性；后又篩選了化合物庫，并對篩選結(jié)果進(jìn)行了初步驗證，結(jié)果表明該篩選系統(tǒng)具有一定可行性。綜上所述，該系統(tǒng)具有可行、有效、高通量的特征，為結(jié)腸癌的藥物研究提供了一種新的篩選方法，加快抗結(jié)腸癌藥物的研發(fā)。

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Construction and application of KRAS-targeted drug screening system against colon cancer

HE Liu-jun, XIE Yong-li, CEN Shan, ZHOU Jin-ming

Department of Immunobiology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (HE Liu-jun, XIE Yong-li, CEN Shan, ZHOU Jin-ming); Modern Pharmaceutical Innovation Research Center, School of Biochemistry, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China (XIE Yong-li, ZHOU Jin-ming)

To construct a KRAS-targeted drug screening system, providing a new technical means for screening anti-colon cancer drugs.

Firstly, the cell line was selected and the technical conditions of the system were determined. The screening system targeting KRAS was constructed, and the effectiveness of the screening system was evaluated. The screening system was then applied to screen the kinase inhibitor library Z183593-L1200. The screening results are verified to verify the feasibility of the screening system.

After the completion of the screening system, the difference in KRAS expression between Hce8693 and T47D cells measured by the screening system (in-cell Western blot) was consistent with that of the common Western blot. The knockdown efficiency of the siRNA system determined by the screening system was also consistent with that of the common Western blot. The effectiveness of the screening system was initially verified. After screening the compound library Z183593-L1200, the best activity compound PF-04691502 was selected for verification. The concentration gradient experiment showed that the intracellular content of KRAS decreased with the increase of PF-04691502 concentration, and the intracellular content of KRAS showed the concentration of PF-04691502. Gradient-dependent; cell proliferation assay showed that the half effective concentration (IC50) of PF-04691502 on Hce8593 cells was 3.546 μmol/L, further verifying the feasibility of the system.

The KRAS-targeted anti-colon cancer drug screening system has certain validity and feasibility. It can be used for high-throughput screening of drugs with KRAS protein as a drug target, and provides a new drug development for a screening method.

High-throughput model; Colon cancer; KRAS; In-cell Western blot

ZHOU Jin-ming, Email: zhou_jim@hotmail.com; CEN Shan, Email: Shancen@hotmail.com

國家自然科學(xué)基金（81672559）

周金明，Email：zhou_jim@hotmail.com；岑山，Email：shancen@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.03.005

2019-10-08