劉丹花，馬記平，張智強，范明松

(1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，鄭州 450064；2.天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司，天津 300301；3.上海雷允上藥業(yè)有限公司技術(shù)中心，上海 201401)

白楊素主要來源于葳科植物木蝴蝶[Oroxylumindicum(L.)Vent.]種子、莖皮等，屬于黃酮類化合物。最新的藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，白楊素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、防止心腦血管疾病等多種藥理作用[1-2]。但白楊素溶解度僅為73.53 μg·mL-1[3]，水溶性較差，導(dǎo)致白楊素很難在體內(nèi)吸收，臨床應(yīng)用受到極大限制。本課題組對白楊素磷脂復(fù)合物、固體脂質(zhì)納米粒等對白楊素生物利用度的提高情況進行研究[3-4]。但磷脂復(fù)合物給藥便捷性存在一定問題(半固體狀態(tài))，而白楊素固體脂質(zhì)納米粒載藥量及包封率不高，限制了它們的使用。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured lipid carriers，NLC)[5-6]是在固體脂質(zhì)納米?；A(chǔ)上發(fā)展起來的新型脂質(zhì)納米載體。NLC是以一定比例的液態(tài)脂質(zhì)或混合脂質(zhì)代替固體脂質(zhì)納米粒的固態(tài)脂質(zhì)[7]，可以提高固體脂質(zhì)納米粒的載藥量，增加穩(wěn)定性等特點[8]，受到國內(nèi)外制劑學(xué)者的廣泛關(guān)注。筆者在本研究將白楊素制備成NLC，并進行質(zhì)量評價及大鼠體內(nèi)研究，為白楊素的制劑革新提供實驗參考，也為其他難溶性中藥活性成分開發(fā)研究提供經(jīng)驗[9]。

1 動物、材料與儀器

1.1動物 清潔級SD大鼠，體質(zhì)量(300±20)g，河南省動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫)2016-0001。動物飼養(yǎng)在清潔級實驗環(huán)境，溫度(25±2) ℃，相對濕度(55±5)%。

1.2試藥 白楊素(成都嘉葉生物科技有限公司，批號：170530，含量>98.5%)；白楊素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111701-201503)；柚皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：05-2010)；山崳酸甘油酯(Compritol 888 ATO，德國BASF公司)；油酸(上海輔必成醫(yī)藥科技有限公司，批號：B20171020T)；甘露醇(天津市富晨化學(xué)試劑公司)；泊洛沙姆188(型號：WPEE587E，德國BASF公司)；Solutol HS-15(德國BASF公司)。

1.3儀器 U3000型高效液相色譜儀(戴安中國有限公司，DAD檢測器)；DF-101S型磁力攪拌器(鞏義市豫華有限責(zé)任公司)；AL204型電子天平(賽多利斯儀器北京有限公司，感量：0.01 mg)；XW-80A型渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；JY92-II型超聲波細胞粉碎儀(寧波新知科儀器研究所)；透析袋(截留相對分子質(zhì)量：10 000，南京森貝伽生物科技有限公司)；MD200-5型氮氣吹掃儀(杭州奧威儀器有限公司)；Alpha 1-2LD型冷凍干燥儀(德國Christ公司)；Master-sizer型粒度分析儀(英國馬爾文儀器公司)；M110-EH型高壓微射流勻質(zhì)機(美國Microfluidics公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1HPLC分析方法的建立

2.1.1色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.15%甲酸(65：35)；波長：220 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.1.2溶液配制 白楊素對照品于45 ℃真空干燥箱中放置36 h。精密稱取對照品25.0 mg，置于100 mL量瓶中，乙腈超聲溶解后，40 min后用乙腈定容，即得250 μg·mL-1白楊素對照品儲備液，冰箱密封保存。

2.1.3線性關(guān)系考察 取白楊素對照品儲備液適量，進一步用乙腈稀釋配制成5.0，12.5，25.0，50.0，100.0及125.0 μg·mL-1系列濃度，HPLC進樣。以白楊素對照品濃度(C)，與峰面積(A)進行線性回歸，得到白楊素的線性回歸方程：A=1.181 3C-0.010 9(r=0.999 9)?？梢姲讞钏卦?.0～125.0 μg·mL-1濃度范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.4精密度實驗 取濃度為5.0，50.0及125.0 μg·mL-1對照品溶液，進行精密度實驗。結(jié)果顯示，低、中、高濃度的日內(nèi)精密度RSD(n=3)值分別為0.62%、0.27%和0.44%；日間精密度RSD值(n=3)分別為0.74%、0.53%和0.39%。

2.1.5回收率實驗 分別于空白NLC溶液中加入低、中、高3種質(zhì)量濃度白楊素對照品，計算得平均加樣回收率(n=3)分別為100.06%，99.84%和100.11%，RSD分別為1.32%、1.68%和0.83%。因此，該HPLC方法可用于白楊素的含量測定。

2.2包封率及載藥量的測定 采用超濾法測定白楊素NLC包封率及載藥量[7]。量取白楊素NLC混懸液2.0 mL轉(zhuǎn)移至超速離心管(10 kDa)，于溫度為0 ℃，轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1(r=15 cm)的條件下離心50 min。收集濾液，HPLC法進樣，測定游離白楊素含量(M游離)。精密量取同體積白楊素NLC混懸液轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加入乙腈約20 mL，進行超聲破壞脂質(zhì)載體結(jié)構(gòu)后定容，HPLC法進樣測定白楊素總含量(M總)。計算NLC的包封率及載藥量。包封率(%)=[(M總-M游離)/M總]×100%；載藥量(%)=[(M總-M游離)/M質(zhì)]×100%。式中M總表示白楊素總量，M游離表示游離白楊素的量，M質(zhì)表示白楊素NLC總質(zhì)量。

2.3白楊素NLC的制備及工藝優(yōu)化

2.3.1白楊素NLC的制備工藝 固定白楊素20 mg，稱取山崳酸甘油酯和油酸適量，置于圓底燒瓶，水浴加熱(75 ℃)熔融后作為油相。配制1%泊洛沙姆188和1%的Solutol HS-15水溶液，兩者按照一定比例混合，加熱至相同溫度后作為水相。于攪拌速度為1 200 r·min-1條件下，先將水相10 mL緩慢加入到油相中，攪拌20 min后加入剩余水相10 mL，敞口繼續(xù)攪拌1.5 h即得初乳。初乳于微射流勻質(zhì)機中在800 MPa下乳勻5次，即得白楊素NLC?？瞻譔LC同法制備。

2.3.2正交實驗優(yōu)化 根據(jù)前期白楊素NLC單因素考察結(jié)果，以納米粒的包封率作為評價指標(biāo)，選擇山崳酸甘油酯用量(A，mg)，油酸用量(B，mg)，表面活性劑體積比(C)，水相體積(D，mL)4個因素為主要影響因素，每個因素設(shè)置3個考察水平，見表1，正交實驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交實驗因素水平表

表2 正交實驗設(shè)計與結(jié)果

由表2可知，各因素對白楊素NLC包封率影響的順序依次為A>B>C>D，最佳組合為A2B2C1D2，根據(jù)方差分析結(jié)果，因素A山崳酸甘油酯用量對白楊素NLC的包封率有顯著性差異。綜合分析得出優(yōu)化后的處方：山崳酸甘油酯為200 mg，油酸用量為40 mg，1%泊洛沙姆188和1% Solutol HS-15水溶液體積比為2：1，水相體積為25 mL。

表3 方差分析結(jié)果

F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.0

2.4白楊素NLC工藝驗證及凍干粉末的制備 按照優(yōu)化后的處方工藝制備3批白楊素NLC，測試結(jié)果顯示，包封率為(84.92±1.38)%。白楊素NLC凍干粉末制備工藝為：取NLC混懸液3 mL，置于西林瓶中，加入5%甘露醇。置于-75 ℃超低溫冰柜進行預(yù)凍2 d，將冷凍后的西林瓶移到冷凍干燥機中2 d，立即封存，即得白楊素NLC凍干粉末。白楊素NLC凍干前后包封率和載藥量變化情況結(jié)果見表4。

2.5粒徑和Zeta電位測定 取制備的白楊素NLC混懸液，用純化水按照1：4比例稀釋后放入比色池中，測定其粒徑和Zeta電位。白楊素NLC混懸液粒徑和Zeta電位結(jié)果見圖1和圖2。凍干前后粒徑和Zeta電位變化情況見表4。

圖1 白楊素NLC混懸液粒徑分布

Fig.1 Particle size distribution of chrysin nanostructured lipid carrier suspension

2.6白楊素NLC體外釋藥行為 精密量取白楊素NLC混懸液2.0 mL(以溶出介質(zhì)配制)，轉(zhuǎn)移至處理好的透析袋中。用溶出介質(zhì)配制等含量的白楊素混懸液2 mL，置于透析袋中，兩端扎緊。供試品中白楊素含量均為10 mg。置于裝有純化水900 mL的溶出杯中，溫度為(37±1)℃，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1。分別于預(yù)定時間點取樣2.0 mL，同時補進同溫度及同體積的空白溶出介質(zhì)。HPLC法測定各取樣樣品的含量，并計算各個時間點的釋放量，繪制白楊素及其NLC的體外釋放曲線，結(jié)果見圖3。白楊素混懸液在36 h內(nèi)累積釋放度僅為25.06%，白楊素NLC在36 h內(nèi)累積釋放度為77.33%，釋藥速率也大大提高，在考察的時間區(qū)間內(nèi)NLC具有明顯的緩釋特征。

圖2 白楊素NLC混懸液Zeta電位

Fig.2 Zeta potential of chrysin nanostructured lipid carrier suspension

表4 白楊素NLC凍干前后包封率、載藥量、平均粒徑和Zeta電位

樣品包封率載藥量%凍干前84.92±1.387.22±0.31凍干后81.27±0.427.05±0.44樣品平均粒徑/nm分散系數(shù)(PDI)Zeta電位/mV凍干前217.42±11.060.181±0.072-30.4±3.6凍干后234.67±9.160.213±0.051-28.6±3.0

2.7大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究

2.7.1分組及血樣采集 取SD大鼠，雌雄兼用，共12只，隨機分為2組，每組6只。實驗室存放時間約12 h，存放期間禁食，自由飲水。分別灌胃給予SD大鼠白楊素原料藥及其NLC混懸液(以純化水配制)，給藥劑量均為50 mg·kg-1。白楊素混懸液組于0.167，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，8.0和12.0 h時間點眼眶采血約0.3 mL，NLC組于0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，16.0和24.0 h時間點眼眶采血約0.3 mL，血樣置于肝素化的離心管中。迅速于轉(zhuǎn)速為3 500 r·min-1(r=15 cm)條件下離心2 min，將上層血漿于-20 ℃冰箱進行冷凍保存。

圖3 白楊素及其NLC體外釋藥曲線

2.7.2血漿樣品的處理 按照正己烷-二氯甲烷-異丙醇=(80：40：10)配制提取液。精密取于室溫解凍后血漿樣品溶液100 μL，柚皮素內(nèi)標(biāo)溶液50 μL(濃度為0.5 μg·mL-1)置于離心管中。加入提取液3 mL，渦旋提取3 min。以速度為8 000 r·min-1(r=15 cm)離心5 min，轉(zhuǎn)移上層有機相于40 ℃條件下氮氣吹干，殘渣以流動相100 μL復(fù)溶，繼續(xù)以轉(zhuǎn)速為8 000 r·min-1離心5 min。取上清液進HPLC測定含量。

2.7.3對照品溶液的配制及方法學(xué)考察 柚皮素對照品經(jīng)干燥處理。精密稱取柚皮素對照品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇超聲溶解后定容，冰箱保存?zhèn)溆?。繼續(xù)用甲醇稀釋至0.5 μg·mL-1，作為內(nèi)標(biāo)溶液。取“2.1.2”項下白楊素對照品溶液適量，氮氣緩慢吹干后采用大鼠空白血漿，配制成0.1，1.0，2.0，4.5，9.0及18.0 μg·mL-1的一系列血漿樣品對照品溶液，按照“2.7.2”項下血漿處理方法進行處理。以白楊素濃度為橫坐標(biāo)(X)，白楊素峰面積與柚皮素內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)進行線性回歸，得回歸方程為：Y=181.53C+1.11(r=0.992 0)。通過對血漿對照品進行逐步稀釋，發(fā)現(xiàn)定量限為43 ng·mL-1，檢測限為8.4 ng·mL-1。

設(shè)0.1，9.0和18.0 μg·mL-1為低、中、高濃度，進行日內(nèi)精密度和日間精密度考察。結(jié)果顯示，低、中、高濃度血漿樣品的日內(nèi)精密度RSD分別為9.33%、6.74%和7.24%(n=3)。白楊素低、中、高濃度血漿樣品日間精密度RSD分別為8.51%、6.66%和7.34%(n=3)。取0.2，9.0及18.0 μg·mL-1的血漿樣品，分別進行HPLC分析，代入方程計算含量。將測定的質(zhì)量濃度與實際配制的質(zhì)量濃度進行對比，計算回收率。結(jié)果顯示，3種質(zhì)量濃度的血漿樣品回收率在86.57%～94.68%。取白楊素NLC2.0 h時間點的血漿樣品，測定時從冰箱取出，測定完成后于冰箱保存，分析6 d內(nèi)測定白楊素峰面積與柚皮素內(nèi)標(biāo)峰面積比值變化情況，結(jié)果表明，比值變化的RSD值為1.87%，所以血漿樣品在6 d內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.7.4藥動學(xué)結(jié)果 取白楊素原料藥及其NLC制劑，分別經(jīng)大鼠灌胃給藥，按“2.7.2”項下方法處理血漿樣品，并進行含量檢測，藥動學(xué)曲線見圖4。tmax和Cmax采用實測值，藥物濃度-時間曲線下面積(AUC)采用梯形法計算，其中，白楊素原料藥制成NLC后，tmax由(1.86±0.35)h延長至(3.39±0.88)h；Cmax由(0.44±0.09)μg·mL-1提高至(1.73±0.31)μg·mL-1(P<0.01)，AUC0～t由(4.50±0.63)提高至(13.94±1.94)μg·h·mL-1，相對生物利用度提高到3.10倍；AUC0～∞由(4.91±0.69)提高至(14.76±1.53) μg·h·mL-1(P<0.01)。白楊素NLC的tmax、Cmax及AUC0～t與白楊素原料藥相比均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明NLC改變白楊素在體內(nèi)的藥動學(xué)行為。

圖4 白楊素及其NLC藥-時曲線

Fig.4 Drug concentration-time curves of chrysin and its nanostructured lipid carries

3 討論

有研究顯示，白楊素固體脂質(zhì)納米粒包封率為76.63%，載藥量為5.27%[6]。筆者在本研究采用山崳酸甘油酯和油酸作為混合載體制備白楊素NLC，其包封率及載藥量分別為(84.92±1.38)%和(7.22±0.31)%，其包封率及載藥量相比均有一定程度的提高。分析原因：一方面可能是由于液態(tài)脂質(zhì)增加白楊素在脂質(zhì)載體中的溶解度，使更多藥物被包裹進NLC中[8-9]。另一方面固態(tài)和液態(tài)脂質(zhì)的聯(lián)合使用，增加脂質(zhì)載體的晶體混亂程度或缺陷，可有效防止藥物被排擠出去，因而得到了較高的包封率及載藥量。

筆者前期曾經(jīng)采用微乳法制備白楊素NLC，雖然該法設(shè)備要求較低，制備過程簡單，但需要加入大量的乳化劑及助乳化劑，有潛在的溶血反應(yīng)等風(fēng)險。微射流勻質(zhì)法由于無需加入有機溶劑，設(shè)備工藝參數(shù)易于控制，適合大規(guī)?；a(chǎn)，最終采用微射流勻質(zhì)法進行研究。包封率和載藥量的測定方法有高速離心法、透析法及超濾法等，由于高速離心法和透析法測定過程較長，且可能會導(dǎo)致藥物發(fā)生泄露，因而最終采用超濾法進行測定。

藥動學(xué)研究結(jié)果表明，與白楊素原料藥比較，NLC的tmax、Cmax及AUC0～t差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其中，tmax大大延長，與白楊素NLC在體外具有明顯的緩釋特征有關(guān)；Cmax極顯著性提高，與NLC促進藥物吸收有關(guān)?？傊讞钏刂苽涑蒒LC后改變白楊素的體內(nèi)吸收過程，極顯著地提高了白楊素的口服吸收生物利用度，相對生物利用度提高到3.10倍。為充分發(fā)揮白楊素的各種藥理作用奠定基礎(chǔ)，也為白楊素的臨床應(yīng)用提供一種新的研究策略。