馮丹 劉婷 李冠汝 孫麗蘊(yùn)

環(huán)境污染導(dǎo)致大氣臭氧層的破壞日益加劇，紫外線(ultraviolet radiation，UV)輻射水平增加。紫外線輻射，特別是紫外線B(ultraviolet-B，UVB)290～320 nm直接作用于HaCaT細(xì)胞，通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥過程進(jìn)而影響皮膚屏障功能，形成光損傷[1]。UVB輻射抑制HaCaT細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化劑超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)的活性并增加氧化終產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的產(chǎn)生[2]，UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷會(huì)激活炎性細(xì)胞因子，并能夠抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth facor-β,TGF-β)通路調(diào)控的膠原蛋白的表達(dá)[3-4]，這是導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞光損傷的重要內(nèi)容。中醫(yī)藥治療光敏感性皮膚反應(yīng)具有很好的療效，應(yīng)用前景廣闊[5]。蒿秦化斑方在臨床中應(yīng)用治療光敏感性皮膚病取得了較好的療效，由青蒿、秦艽、丹皮、赤芍等組成，其改善光損傷的機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立UVB輻射誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光損傷體外模型，以蒿秦化斑方高、中、低劑量進(jìn)行干預(yù)，觀察蒿秦化斑方對于UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光損傷的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物

蒿秦化斑方湯劑，組方為青蒿30 g、生地黃15 g、水牛角15 g、秦艽10 g、牡丹皮15 g、赤芍15 g、防風(fēng)15 g、生甘草6 g。由北京中醫(yī)醫(yī)院(供貨方：北京盛世龍藥業(yè)有限公司)提供。

1.2 主要器材與試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-15AC型，SANYO)，倒置顯微鏡(XDS-2B型，重慶光電)，超凈臺(tái)(SW-CJ-1D型，江蘇通凈)，分光光度計(jì)(NANODROP 2000，Therno scientific)，酶標(biāo)儀(MultiSkan3，Therno scientific)，離心機(jī)(Centrifuge 5415D，Eppendorf)。

MEM α, Nucleosides(GIBCO，12571063)，EBSS(GIBCO，14155063)，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(GIBCO，12664-025)，胰酶(銳爾康,REK3012)，磷酸緩沖液(銳爾康，REK3005)，MTT(GIBCO，v13145)。

1.3 細(xì)胞及其培養(yǎng)

HaCaT細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，在37℃,5% CO2, 95%濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中用含有10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞密度增加至80%以上時(shí)，用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞毒性的測定

HaCaT細(xì)胞按常規(guī)消化終止后用生長培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，100 μL/孔鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，24小時(shí)后，分別更換含不同劑量(12.1、6.05、3.03 mg/mL)的蒿秦化斑方培養(yǎng)基作用細(xì)胞24小時(shí)，棄掉細(xì)胞原培養(yǎng)基，加入100 μL的1640培養(yǎng)基和10 μL的MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,噻唑藍(lán))溶液，37℃反應(yīng)4小時(shí)后棄掉MTT反應(yīng)液，用10%的十二烷基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate,SDS)充分溶解細(xì)胞，570 nm下讀取吸光值，并計(jì)算細(xì)胞抑制率，選擇細(xì)胞抑制率小于10%的劑量作為最大無毒劑量。進(jìn)行光密度(optical density,OD)值測定時(shí)，分光光度計(jì)上顯示的數(shù)值為每毫升溶液中的OD值，細(xì)胞抑制率=(空白對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白對照組OD值×100%。

在本研究中，默認(rèn)同一批次的細(xì)胞之間沒有個(gè)體差異，為了保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，檢測細(xì)胞增殖情況設(shè)計(jì)為6孔重復(fù)，可有效降低誤差。

1.5 UVB照射與分組

將收集的細(xì)胞隨機(jī)分為5組，A組空白對照組：HaCaT細(xì)胞正常培養(yǎng)；B組UVB模型組：HaCaT細(xì)胞用300 mJ的UVB刺激15分鐘；C組中藥高劑量組：300 mJ的UVB刺激HaCaT細(xì)胞15分鐘后，加入對細(xì)胞抑制率小于10%的最大無毒劑量中藥(此劑量記作C)，作用24小時(shí)；D組中藥中劑量組：300 mJ的UVB刺激HaCaT細(xì)胞15分鐘后，加入C/2劑量中藥，作用24小時(shí)；E組中藥低劑量組：300 mJ的UVB刺激HaCaT細(xì)胞15分鐘后，加入C/4劑量中藥，作用24小時(shí)。

1.6 MTT法檢測細(xì)胞增殖

細(xì)胞模型結(jié)束后，棄掉細(xì)胞原培養(yǎng)基，加入100 μL的1640培養(yǎng)基和10 μL的MTT溶液，37℃反應(yīng)4小時(shí)；棄掉MTT反應(yīng)液，用10%SDS充分溶解細(xì)胞，490 nm下讀取OD值，并計(jì)算細(xì)胞抑制率，觀察各組對細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響；細(xì)胞抑制率=(空白對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白對照組OD值×100%

1.7 吸光度法測定SOD、CAT活性和MDA含量

各組細(xì)胞中加入RIPA裂解液，4℃反應(yīng)30分鐘，離心后收集上清，進(jìn)行定量后調(diào)整密度為2 mg/mL，根據(jù)制造商的說明書添加相應(yīng)樣品，7℃反應(yīng)1小時(shí)；酶標(biāo)儀450 nm下檢測OD值，并計(jì)算SOD酶活性；測MDA含量時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)曲線配制成2 mM 的MDA標(biāo)準(zhǔn)，分別加入0、2、4、6、8、10 μL溶于200 μL(ddH2O)，95℃、60分鐘，冰浴10分鐘后，酶標(biāo)儀532 nm下檢測OD值，并計(jì)算MDA含量。測CAT活性時(shí)將樣本或陽性質(zhì)控液加到每孔，調(diào)整總含量至78 μL，25℃，30分鐘后，加入10 μL的終止液，25℃孵育5分鐘，完全抑制樣本中的過氧化氫酶活性，作為HC，配制1 mM的H2O2，分別加入0、2、4、6、8、10 μL的MmH2O2，調(diào)整至90 μL，加入10 μL的終止液，每孔加入50 μL混合，酶標(biāo)儀570 nm下檢測OD值并計(jì)算CAT活性。注：CAT活性以消耗等量的H2O2所需CAT的含量來測定，消耗等量的H2O2所需CAT含量越多說明CAT活性越低。

在本研究中，默認(rèn)同一批次的細(xì)胞之間沒有個(gè)體差異，為了保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，每個(gè)樣本設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔。

1.8ELISA檢測細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)、血管細(xì)胞間黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)、內(nèi)皮細(xì)胞選擇素(endothelium-selectin,E-selectin)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、TGF-β的含量。

各組細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別處理，在450 nm下讀取吸光值， 以標(biāo)準(zhǔn)品劑量和吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(4-PL曲線擬合)， 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中VCAM-1、 ICAM-1、 E-selectin、 IL-10、 TGF-β的含量。

在本研究中，默認(rèn)同一批次的細(xì)胞之間沒有個(gè)體差異，為了保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，每個(gè)樣本設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性測定確定中藥最大無毒劑量

對細(xì)胞毒性的測定發(fā)現(xiàn)，1.25%中藥對細(xì)胞活性抑制率最低，對應(yīng)的中藥濃度為12.1 mg/mL，因此可以確定中藥最大無毒劑量為12.1 mg/mL。見表1。

表1 不同濃度中藥對HaCaT細(xì)胞的抑制率

2.2 MTT法測定HaCaT細(xì)胞增殖

與空白對照組比較，UVB模型組細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)。與UVB模型組比較，蒿秦化斑方高、中、低劑量組細(xì)胞增殖能力均增強(qiáng)(P<0.05)。見表2。

2.3 吸光度法檢測SOD、CAT、MDA含量

通過吸光度法測定各組細(xì)胞中SOD、CAT的活性以及各組細(xì)胞中MDA的含量。與空白對照組比較，UVB模型組SOD表達(dá)降低(P<0.05)；與UVB模型組比較，蒿秦化斑方高劑量組SOD表達(dá)增多(P<0.05)。與空白對照組比較，UVB模型組分解1 μmol的H2O2所需的CAT量升高，CAT活性降低(P<0.01)；與UVB模型組比較，蒿秦化斑方高劑量組分解1 μmol的H2O2所需CAT量減少，CAT活性增強(qiáng)(P<0.05)。與空白對照組比較，UVB模型組MDA含量增加(P<0.05)；與UVB模型組比較，蒿秦化斑方高劑量組MDA含量降低(P<0.05)。見表3。

表2 高中低濃度中藥組給藥后HaCaT 細(xì)胞增殖水平比較

注： 與空白對照組比較，aP<0.05；與UVB模型組比較，bP<0.05。

2.4 ELISA法檢測ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、TGF-β、IL-10的含量

與空白對照組比較，UVB模型組ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-10表達(dá)增多(P<0.05)，TGF-β表達(dá)降低(P<0.05)；與UVB模型組比較，蒿秦化斑方高劑量組ICAM-1表達(dá)增多(P<0.05)，蒿秦化斑方中、低劑量組ICAM-1表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，蒿秦化斑方高、中、低劑量組VCAM-1、E-selectin、IL-10表達(dá)均增多(P<0.05)，TGF-β表達(dá)均降低(P<0.05)。見表4。

表3 高中低濃度中藥組給藥后HaCaT細(xì)胞SOD、CAT、MDA含量比較

注： 與空白對照組比較，aP<0.05；與UVB模型組比較，bP<0.05。

表4 高中低濃度中藥組給藥后HaCaT細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、TGF-β、IL-10含量比較

注： 與空白對照組比較，aP<0.05；與UVB模型組比較，bP<0.05。

3 討論

UVB照射引起的光損傷，中醫(yī)稱之為“日曬瘡”，《外科啟玄》對日曬瘡有如下記載：“三伏炎天，勤苦之人，勞于任務(wù)，不惜身命，受酷日曬曝，先疼后破而成瘡著，非血?dú)馑??！北静∈怯捎趶?qiáng)烈日光照射所致，以在曝曬處皮膚發(fā)生紅斑、水腫或水皰等損害為臨床表現(xiàn)，治療中以清熱除濕，涼血解毒為主[5]。 蒿秦化斑方具有清熱解毒、 涼血化斑之效。既往研究證明以青蒿、赤芍等清熱涼血解毒之品為主要組成成分的中藥抗光敏合劑可明顯改善皮膚光損傷[6]。因此，探討蒿秦化斑方對HaCaT細(xì)胞的光損傷影響及其可能作用機(jī)制有積極意義。

青蒿苦寒清熱，具有清熱涼血的功效?；莺Ｓ⒌萚7]發(fā)現(xiàn)青蒿素可通過抑制炎性因子的產(chǎn)生對UVB所致光損傷起到保護(hù)作用。秦艽、水牛角、生地黃具有涼血消斑的功效。秦艽主要成分龍膽苦苷和獐牙菜苦苷具有抗炎作用[8]。生地黃有效成分梓醇具有抗氧化、抗炎作用[9]。丹皮、赤芍、防風(fēng)共奏祛風(fēng)涼血止癢之效。丹皮酚具有抗皮膚過敏、抗炎的作用[10]。赤芍中沒食子酸丙酯可通過增強(qiáng)SOD活性，降低MDA量發(fā)揮抗氧化作用[11]。防風(fēng)辛溫發(fā)散，善于祛風(fēng)止癢,防風(fēng)多糖的抗氧化、抗炎特性得到了證實(shí)[12]。生甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥，甘草總黃酮可通過降低MDA量，增強(qiáng)SOD活性，清除自由基以發(fā)揮到抗氧化的作用[13]。

在本研究中，通過建立HaCaT細(xì)胞UVB光損傷體外模型，檢測蒿秦化斑方對HaCaT細(xì)胞增殖、抗氧化防御能力標(biāo)志物(SOD、CAT)、氧化產(chǎn)物MDA和炎癥因子(ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、TGF-β和IL-10)表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)中模型組細(xì)胞增殖能力降低，抗氧化酶活性降低，氧化產(chǎn)物增多，炎癥因子表達(dá)增多，提示成功建立HaCaT細(xì)胞光損傷模型。

UVB通過誘導(dǎo)減少內(nèi)源性抗氧化劑(SOD、CAT)來促進(jìn)氧化應(yīng)激[14]。UVB照射引發(fā)的氧化應(yīng)激是過量自由基降低SOD和CAT的活性，破壞自由基和抗氧化酶之間的平衡，脂質(zhì)過氧化物MDA過度積累的過程，MDA的細(xì)胞毒活性能夠加劇氧化損傷[15]。SOD和CAT的活性、MDA含量是評價(jià)HaCaT細(xì)胞氧化損傷的重要指標(biāo)。結(jié)果顯示在UVB照射后抗氧化劑SOD和CAT活性下降，而氧化產(chǎn)物MDA的含量增加，蒿秦化斑方高劑量組的SOD和CAT活性增強(qiáng)，MDA含量降低。中、低劑量組SOD和CAT活性、MDA含量沒有變化，提示高劑量蒿秦化斑方可以通過增強(qiáng)抗氧化酶(SOD、CAT)活性，降低氧化終產(chǎn)物MDA水平，改善氧化損傷。近期發(fā)現(xiàn)蟲草中分離的抗氧化物能夠通過增強(qiáng)SOD活性，降低MDA的含量，清除自由基，修復(fù)UVB誘導(dǎo)的氧化損傷[16]。二氫咖啡酸可以通過增強(qiáng)CAT的活性來減弱UVB照射造成的氧化損傷[17]，這與課題組的研究結(jié)果一致。

UVB輻射影響免疫和炎癥反應(yīng)的過程[18]。VCAM-1、ICAM-1、E-selectin是皮膚炎癥和免疫刺激相關(guān)分子。據(jù)報(bào)道，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多形性日光疹皮膚中這些粘附分子表達(dá)上調(diào)[19]。燕華玲等[20]發(fā)現(xiàn)，多形性日光疹患者血清中ICAM-1和E-selectin表達(dá)顯著升高。VCAM-1作為炎性介質(zhì)介導(dǎo)免疫反應(yīng)的同時(shí)促使炎癥級(jí)聯(lián)放大[21]。UVB照射使IL-10產(chǎn)生增加，IL-10可抑制局部免疫反應(yīng)，如接觸性超敏反應(yīng)和延遲型超敏反應(yīng)[22]。VCAM-1、ICAM-1、E-selectin和IL-10可以作為表征細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)。結(jié)果顯示，UVB照射后VCAM-1、ICAM-1和E-selectin含量均升高，蒿秦化斑方高劑量組ICAM-1含量降低，蒿秦化斑方中、低劑量對ICAM-1的含量沒有影響。蒿秦化斑方高、中、低劑量組VCAM-1和E-selectin的含量均降低，研究說明高劑量蒿秦化斑方能夠抑制炎癥因子的表達(dá)，改善UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞的免疫和炎癥反應(yīng)。

UVB誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥，最終會(huì)導(dǎo)致皮膚屏障結(jié)構(gòu)受損，形成難以愈合的傷口，細(xì)胞增殖和膠原蛋白的合成能夠修復(fù)皮膚屏障[23]。TGF-β具有組織修復(fù)作用，能夠調(diào)節(jié)膠原蛋白的穩(wěn)態(tài)[24]，研究發(fā)現(xiàn)[25]，脂質(zhì)介體雷索文D1通過增加TGF-β的表達(dá)對UVB照射引起的皮膚炎癥和氧化應(yīng)激有明顯改善作用。研究顯示，UVB照射抑制了HaCaT細(xì)胞的增殖和TGF-β的表達(dá)，蒿秦化斑方高、中、低劑量組均能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖，促進(jìn)TGF-β的產(chǎn)生。提示蒿秦化斑方可以通過細(xì)胞增殖和膠原蛋白的重組修復(fù)受損細(xì)胞。

綜上所述，高劑量蒿秦化斑方能夠改善UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光損傷，其作用機(jī)制可能與以下三個(gè)方面有關(guān)：抑制氧化應(yīng)激，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，修復(fù)細(xì)胞屏障功能。這三方面共同起到保護(hù)HaCaT細(xì)胞免受光損傷的作用。