周敏 賈湘隆 徐旭英

糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)是糖尿病微血管并發(fā)癥中最常見最嚴(yán)重的一種，多發(fā)生在糖尿病血管損傷致組織缺血、壞死、感染之后，發(fā)病后未及時(shí)規(guī)范治療往往會(huì)使病情進(jìn)行性加重[1]，致殘致畸率極高，截肢(趾)術(shù)后5年病死率甚至高達(dá)50%～68%[2]。促進(jìn)創(chuàng)面愈合是目前糖尿病足潰瘍臨床治療與科學(xué)研究的重要著眼點(diǎn)，但現(xiàn)有的治療方案往往起效慢且療效不佳，急需安全有效的治療手段促進(jìn)創(chuàng)面愈合。創(chuàng)面修復(fù)的首要基礎(chǔ)是血管新生帶來的有效血氧供應(yīng)，微血管內(nèi)皮細(xì)胞通過多種方式參與血管新生及創(chuàng)面修復(fù)，改善糖尿病足潰瘍微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能有助于治療糖尿病足潰瘍?；仃?yáng)生肌膏是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院的一種外用制劑，在臨床應(yīng)用了數(shù)十年，已有研究對(duì)其促血管新生、促創(chuàng)面愈合的安全性及有效性進(jìn)行了驗(yàn)證[3]，本研究對(duì)2018年12月至2019年6月間北京中醫(yī)醫(yī)院瘡瘍血管外科住院部的大腿截肢患者進(jìn)行了標(biāo)本采集，按課題組前期研究報(bào)道的人來源原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)[4]，通過進(jìn)行細(xì)胞學(xué)體外實(shí)驗(yàn)，探討回陽(yáng)生肌膏對(duì)人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，以期進(jìn)一步明確回陽(yáng)生肌膏促進(jìn)微血管新生、促創(chuàng)面愈合的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均來自北京中醫(yī)醫(yī)院瘡瘍血管外科住院部2018年12月至2019年6月行大腿截肢患者，取大腿截肢后創(chuàng)面周圍皮膚和截除大腿近心端皮膚的真皮層。本實(shí)驗(yàn)符合中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院頒發(fā)的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》，經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)論證并同意通過，標(biāo)本采集前充分告知患者實(shí)驗(yàn)方案并簽署知情同意書。

1.2 藥物

回陽(yáng)生肌膏由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院瘡瘍血管外科提供，由肉桂、炮姜、人參、黃芪、當(dāng)歸、白芥子、白蘞等藥物與凡士林調(diào)勻制成。龍珠軟膏由武漢馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供，批號(hào)：110301。

1.3 人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離與培養(yǎng)

采集標(biāo)本后立即放入含雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，分離原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞：PBS沖洗組織3次，于DMEM培養(yǎng)基中將組織修剪成 1 mm3大小，轉(zhuǎn)移至預(yù)濕培養(yǎng)皿，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2小時(shí)，加入含20%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)60小時(shí)，去除組織塊并更換培養(yǎng)基，純化細(xì)胞：滴3滴胰酶，10秒后吸棄舊培養(yǎng)基，加新培養(yǎng)基，每日1次換液，待細(xì)胞鋪滿單層后凍存或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基由 90%1640培養(yǎng)基、5%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物(endothelial cell growth supplement，ECGS)、5%FBS配制，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1640培養(yǎng)基(GIBCO，11875-085)，F(xiàn)BS(GIBCO，12664-025)，ECGS(ScienCell，1052)，RIPA總蛋白提取試劑盒(Sigma，R0278)，PMSF(Sigma，PMSF-RO)，蛋白酶抑制劑(Roche，11697498001)，BCA蛋白定量試劑盒(Sigma， BCA1)等；IgG抗體(H+L)、HRP(Jackson，111035003)，GAPDH抗體(天津銳爾康生物科技有限公司， REK0005)，MTT Cell Viability Assay(Thermo， V13154)，VEGFR2抗體(CST， 2479)。流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，Callibur II型)，倒置熒光顯微鏡(Nikon，T1000)，酶標(biāo)儀(Therno scientific MultiSkan3)，電泳儀(Therno scientific Mini，Ge Tank)，轉(zhuǎn)膜儀(Therno scientific，Mini Blot Module)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均為原代或1～3代，共分為4組：將截除肢體的近心端皮膚標(biāo)本所得微血管內(nèi)皮細(xì)胞分為空白組，創(chuàng)面周圍皮膚標(biāo)本所得微血管內(nèi)皮細(xì)胞分別分為模型組、回陽(yáng)生肌膏組、龍珠軟膏組。空白組、模型組均不予干預(yù)，回陽(yáng)生肌膏組與龍珠軟膏組分別予最大無毒濃度Cmax1、Cmax2藥物，作用時(shí)間均為48小時(shí)。

1.6 MTT法篩選藥物最大無毒濃度

取空白組細(xì)胞，胰酶消化后制備為單細(xì)胞懸液，按細(xì)胞數(shù)1×104個(gè)、體積100 μL，接種于96孔板，共11個(gè)組，每組6個(gè)副孔，細(xì)胞貼壁后，吸棄舊培養(yǎng)基，隨機(jī)10個(gè)組分別加入1640培養(yǎng)基配制的不同濃度(200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL)回陽(yáng)生肌膏、龍珠軟膏100 μL，對(duì)照組僅加100 μL 1640培養(yǎng)基，作用48小時(shí)后加MTT溶液，置于37℃培養(yǎng)箱4小時(shí)；吸棄溶液，10% SDS溶解細(xì)胞，570 nm下讀吸光值，按公式：細(xì)胞抑制率=[對(duì)照組光密度(optical density,OD)值-實(shí)驗(yàn)組OD值]/對(duì)照組OD值×100%，計(jì)算細(xì)胞抑制率。運(yùn)用GraphPad Prism 6.0計(jì)算出回陽(yáng)生肌膏、龍珠軟膏作用于人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)的最大無毒濃度，即Cmax1、Cmax2。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組處理48小時(shí)后，以胰酶消化，各組分別制備100 μL密度為1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，每組加10 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，室溫避光反應(yīng)30分鐘后加400 μL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，收取細(xì)胞15000個(gè)/樣，不足15000個(gè)收取全部細(xì)胞；應(yīng)用CellQuest軟件分析各組的細(xì)胞凋亡率。

1.8 ELISA檢測(cè)相關(guān)因子

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，各組細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別處理48小時(shí)，按試劑盒操作說明書進(jìn)行樣本提取，細(xì)胞上清樣品未做稀釋，檢測(cè)各組細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metallopeptidase 1,MMP1)、MMP9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase 1，TIMP1)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑2(TIMP2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)量。

1.9 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力

在24孔中放置Transwell小室，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組，上室加入對(duì)應(yīng)分組的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，下室加入培養(yǎng)基及對(duì)應(yīng)分組藥物，培養(yǎng)48小時(shí)后，PBS洗2次，加細(xì)胞固定劑500 μL/孔，置于室溫20分鐘；PBS洗滌2次，加0.4%的結(jié)晶紫500 μL/孔，室溫染色10分鐘；PBS洗滌10次，顯微鏡拍照同時(shí)對(duì)各組細(xì)胞的遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.10 Western blot 法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

提取六孔板內(nèi)細(xì)胞總蛋白，BCA法行蛋白定量，待檢測(cè)蛋白樣品上樣量為13 μg/孔，加入濃縮膠配 SDS-PAGE 膠，電泳：選擇MOPS緩沖體系，恒壓90 V，約20分鐘后恒壓120 V；轉(zhuǎn)膜，封閉，5%脫脂奶粉-TBS室溫輕搖膜30分鐘，分別加入VEGFR2抗體(1∶1000稀釋)和GAPDH抗體(1∶10000稀釋)，室溫孵育一抗10分鐘，4℃過夜。洗膜，室溫下孵育二抗40分鐘，洗膜后ECL法顯影曝光。應(yīng)用Image J軟件分析WB檢測(cè)各條帶的灰度值，并按公式計(jì)算各組細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 藥物無毒濃度篩選結(jié)果

回陽(yáng)生肌膏濃度為12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、龍珠軟膏濃度為12.5 μg/mL均能在一定程度上促進(jìn)人來源內(nèi)皮細(xì)胞增殖?？紤]到微血管內(nèi)皮細(xì)胞均取自糖尿病足潰瘍截肢患者，對(duì)應(yīng)的高糖、缺血等病理狀態(tài)使空白組細(xì)胞的功能已有一定下降，因此選擇抑制率<10%情況下的最大濃度為后續(xù)試驗(yàn)濃度為回陽(yáng)生肌膏50 μg/mL、龍珠軟膏25 μg/mL，結(jié)果見表1。

2.2 回陽(yáng)生肌膏對(duì)人糖尿病足創(chuàng)面內(nèi)皮細(xì)胞抑制凋亡水平的影響

與空白組相比，模型組的總凋亡率顯著增高(P<0.05)；與模型組相比，回陽(yáng)生肌膏組的總凋亡率降低(P<0.05)，龍珠軟膏組的總凋亡率也明顯降低(P<0.05)；回陽(yáng)生肌膏組的凋亡率與龍珠軟膏組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見表2、圖1。

表1 藥物無毒濃度篩選結(jié)果

注：與空白組比較，aP<0.05。

2.3 回陽(yáng)生肌膏對(duì)人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞中MMP1、MMP9、TIMPI、TIMP2及VEGF表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組MMP1、TIMP1含量均明顯增高(P<0.05)，MMP9含量顯著增高(P<0.05)，TIMP2含量明顯降低(P<0.05)，VEGF含量顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，回陽(yáng)生肌膏組與龍珠軟膏組的MMP9含量均明顯降低(P<0.05)、VEGF含量均明顯升高(P<0.05)，回陽(yáng)生肌膏組的TIMP1水平出現(xiàn)降低(P<0.05)，龍珠軟膏組有降低趨勢(shì)，回陽(yáng)生肌膏組與龍珠軟膏組的MMP1、TIMP2也有降低趨勢(shì)。結(jié)果見表3。

表2 各組人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平比較

注： 與模型組比較，aP<0.05。

表3 各組人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶類、抑制劑類及VEGF含量水平比較

注： 與模型組比較，aP<0.05。

注：A空白組；B模型組；C回陽(yáng)生肌膏組；D龍珠軟膏組。

圖1 各組人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞流式凋亡圖

2.4 回陽(yáng)生肌膏對(duì)人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響

與空白組相比，模型組遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，回陽(yáng)生肌膏處理后遷移細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)；經(jīng)龍珠軟膏處理后遷移細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)；回陽(yáng)生肌膏組的細(xì)胞遷移數(shù)與龍珠軟膏組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表4、圖2。

表4 各組人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力情況

注： 與模型組比較，aP<0.05。

2.5 回陽(yáng)生肌膏對(duì)人糖尿病足創(chuàng)面內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR2蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組VEGFR2蛋白相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，回陽(yáng)生肌膏組、龍珠軟膏組VEGFR2蛋白相對(duì)表達(dá)量均增高(P<0.05)，而回陽(yáng)生肌膏組的VEGFR2水平與龍珠軟膏組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表5、圖3。

注：A空白組；B模型組；C回陽(yáng)生肌膏組；D龍珠軟膏組。

圖2 各組人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移情況(×200)

表5 各組人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量

注： 與模型組比較，aP<0.05。

注：A空白組；B模型組；C回陽(yáng)生肌膏組；D龍珠軟膏組。

圖3 Western blot測(cè)定各組人來源微血管細(xì)胞VEGFR2蛋白的表達(dá)

3 討論

截至2015年全球約4.15億成人罹患糖尿病，帶來的衛(wèi)生支出總額約為6730億美元[5]，其中約有19%～34%的糖尿病患者在有生之年可能患糖尿病足潰瘍[5-6]，其中占大多數(shù)的慢性難愈性瘡面也被稱為慢性糖尿病足潰瘍，與中醫(yī)糖尿病足潰瘍陰證創(chuàng)面十分相似：病變部位深(多在血脈、筋骨)，創(chuàng)面膿質(zhì)稀薄，肉芽蒼白或紫黯，創(chuàng)周皮色蒼白、紫黯[7]，往往遷延難愈。根據(jù)2017年的《中國(guó)糖尿病足診治指南》指出目前的治療方向主要是在內(nèi)科治療基礎(chǔ)上促進(jìn)創(chuàng)面愈合，常用手段主要是外科手術(shù)清創(chuàng)，也有自溶、化學(xué)、機(jī)械及生物等清創(chuàng)方法，除此之外還有自體皮膚移植、敷料、血管重建、生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞、基因等[8]治療方法。上述手段雖能在一定程度上延緩疾病進(jìn)展，但往往速度緩慢、創(chuàng)面愈合效果不佳。在創(chuàng)面愈合中，血管新生帶來的有效血氧供應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與細(xì)胞因子的輸送是基礎(chǔ)保障[9]，微血管內(nèi)皮細(xì)胞在目前已知血管新生的兩種實(shí)現(xiàn)方式中均扮演了不可或缺的角色，主要通過增殖遷移成管及合成分泌MMPs參與血管新生。創(chuàng)面早期MMPs 能降解血管基底膜，增加血管通透性幫助微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖成管以及發(fā)芽形成新生血管網(wǎng)[10]，但MMP1、MMP9的過度表達(dá)往往導(dǎo)致高蛋白水解并激發(fā)過度炎癥反應(yīng)，限制細(xì)胞遷移增殖、阻礙上皮化，導(dǎo)致創(chuàng)面難以愈合[11]。TIMP類是MMP類的天然內(nèi)源抑制劑，可由內(nèi)皮細(xì)胞合成，與MMP特異性結(jié)合能不可逆地抑制MMP活性改善過度水解，但有研究發(fā)現(xiàn)過高的TIMP1會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，過高的TIMP2會(huì)抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移[12]，MMPs、TIMPs的過高表達(dá)均不利于血管新生和創(chuàng)面愈合。前面提到的MMPs在降解過程中還能通過刺激細(xì)胞因子的分泌參與血管新生，其中就主要包括生長(zhǎng)因子VEGF[13]，VEGFR2與VEGF的結(jié)合激活可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，增強(qiáng)血管通透性，除此之外還可影響下游PIK3/Akt通路促進(jìn)血管新生[14]，這與課題組發(fā)現(xiàn)的回陽(yáng)生肌膏能影響PIK3/Akt通路實(shí)現(xiàn)促血管新生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合[15]，VEGF/VEGFR2通路在誘導(dǎo)血管新生中也起著重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)回陽(yáng)生肌膏與龍珠軟膏均能抑制人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞在糖尿病足潰瘍狀態(tài)下的MMP9過度表達(dá)，對(duì)MMP1、TIMP2的表達(dá)也有下調(diào)趨勢(shì)，但回陽(yáng)生肌膏對(duì)TIMP1含量的下調(diào)作用是龍珠軟膏所沒有的，除此之外，兩種藥物均能增加VEGF、VEGFR2的表達(dá)，龍珠軟膏據(jù)報(bào)道在治療糖尿病足潰瘍中具有促創(chuàng)面愈合，減輕局部疼痛的效果[16]，結(jié)合本科室臨床治療糖尿病足潰瘍陰證創(chuàng)面的療效，回陽(yáng)生肌膏在促進(jìn)糖尿病足潰瘍陰證創(chuàng)面愈合方面的療效可能高于龍珠軟膏。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院瘡瘍血管外科的回陽(yáng)生肌膏在業(yè)內(nèi)享有盛譽(yù)，具有促新生血管生成、促創(chuàng)面愈合作用[17]，由肉桂、炮姜、人參、鹿茸、白芥子、艾葉、黃芪、當(dāng)歸、赤芍等藥物組成，其中黃芪性甘微溫，善益氣健脾，溫分肉，肥腠理，為外科家之圣藥，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能提升血管內(nèi)皮細(xì)胞活力[18]，另一方面還能通過PI3K/AKT通路保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[19]，人參所含人參皂苷能上調(diào)VEGFA、VEGFR2[20]，人參、黃芪共奏益氣之效；肉桂辛甘大熱，補(bǔ)火助陽(yáng)，活血通經(jīng)，能夠引導(dǎo)陽(yáng)氣宣通血脈，肉桂中的肉桂醛的抗氧化作用能保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[21]，對(duì)體外成纖維細(xì)胞MMP1的過度表達(dá)也有下調(diào)作用，而鹿茸能上調(diào)VEGF表達(dá)[22]，肉桂、鹿茸與炮姜、艾葉有溫陽(yáng)散寒之功，配伍當(dāng)歸、赤芍養(yǎng)血活血，赤芍中赤芍總苷能降低MMP9、TIMP1表達(dá)[23-24]，以上諸藥配伍能“溫陽(yáng)益氣，活血生肌”，使回陽(yáng)生肌膏能通過調(diào)控MMPs與TIMPs、VEGF與VEGFR2表達(dá)，改善糖尿病足潰瘍陰證創(chuàng)面狀態(tài)下的微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移功能，促進(jìn)血管新生，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面愈合。

糖尿病足潰瘍陰證創(chuàng)面原本多“虛”多“瘀”，機(jī)體多脾腎陽(yáng)虛、陰血不足，使機(jī)體氣化無能，表現(xiàn)為創(chuàng)面板結(jié)晦澀、肉芽紫黯蒼白、膿液稀薄，創(chuàng)面難以愈合，此類無血管新生、肉芽組織難以生長(zhǎng)的創(chuàng)面應(yīng)用回陽(yáng)生肌膏后，膿液先由稀薄逐漸增多黃稠，而后再逐漸減少但仍淡黃，肉芽逐漸鮮明紅活，創(chuàng)周、創(chuàng)底逐漸向愈斂和，這一現(xiàn)象與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的回陽(yáng)生肌膏在體外對(duì)人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響有關(guān)，其機(jī)制可能是回陽(yáng)生肌膏抑制了MMPs的過度表達(dá)改善了過度水解，對(duì)TIMP1的下調(diào)抑制了細(xì)胞凋亡，對(duì)TIMP2的下調(diào)增強(qiáng)了細(xì)胞遷移，從而促進(jìn)血管新生實(shí)現(xiàn)了促創(chuàng)面愈合。另一方面，通過刺激VEGF/VEGFR2的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞完成增殖遷移實(shí)現(xiàn)血管新生，并且影響PIK3/Akt通路改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，也是回陽(yáng)生肌膏促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制之一。筆者猜想應(yīng)用回陽(yáng)生肌膏后，基質(zhì)金屬蛋白酶發(fā)揮的降解作用使壞死組織變得易于清除，創(chuàng)面膿液由原先的稀薄逐漸增多黃稠，實(shí)現(xiàn)“去腐”，為后續(xù)“生新”打下基礎(chǔ)，為防止過度降解對(duì)TIMP1、TIMP2的表達(dá)進(jìn)行了調(diào)控以抑制MMP1、MMP9的活性，或許這是膿液增多后再逐漸減少的原因；而當(dāng)MMP/TIMP的比值到達(dá)相對(duì)平穩(wěn)時(shí)，繼續(xù)應(yīng)用回陽(yáng)生肌膏使MMP、TIMP的表達(dá)均有所下調(diào)，從而保證了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移；回陽(yáng)生肌膏上調(diào)VEGF、VEGFR2的表達(dá)，膿液由原先的稀薄逐漸變?yōu)辄S稠，血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖促使血管新生網(wǎng)絡(luò)形成，提供的血氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使肉芽紅活，創(chuàng)面愈合，這一“回陽(yáng)以生肌，祛瘀以生新”過程正是回陽(yáng)生肌膏理論依據(jù)“陽(yáng)生陰長(zhǎng)”的體現(xiàn)。

但在臨床實(shí)際中創(chuàng)面愈合始終處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，本實(shí)驗(yàn)中人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)本采集與分離培養(yǎng)非常不易，數(shù)量有限，且試驗(yàn)均采用原代或1～3代細(xì)胞，僅對(duì)回陽(yáng)生肌膏體外干預(yù)人來源微血管內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)進(jìn)行了檢測(cè)，若后期條件充分，考慮進(jìn)行多時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)對(duì)比，結(jié)合臨床試驗(yàn)，以期更全面地探究回陽(yáng)生肌膏是如何動(dòng)態(tài)地影響微血管內(nèi)皮細(xì)胞來促進(jìn)血管新生、創(chuàng)面愈合。