周 偉，陳 軒，蔣 娟，胡雪筠，李占彬，龍?jiān)拼?，?菁， 周少奇，2▲

(1貴州科學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550001；2華南理工大學(xué) 環(huán)境與能源學(xué)院，廣東 廣州 510006)

0 引言

環(huán)保酵素是由廚余(鮮垃圾)、糖和水經(jīng)自然發(fā)酵后產(chǎn)生的棕色液體，是一種由植物蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和保幼激素天然合成的有機(jī)化合物，一般由一份廚余垃圾、一份紅糖以及十份水為混合，裝入密封蓋口的塑料容器，倒入約占容器60%的體積，經(jīng)過(guò)三個(gè)月發(fā)酵后形成的活性發(fā)酵液。環(huán)保酵素富含多種生物酶及大量有益微生物如酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等，以及特定功能菌如纖維素降解菌、耐酸菌、硝化菌等和酶類(lèi)物質(zhì)，可抑制環(huán)境中的有害微生物類(lèi)群的繁殖，尤其是病原菌和腐敗細(xì)菌的生物活動(dòng)，這些物質(zhì)具有良好的環(huán)境修復(fù)功能，同時(shí)環(huán)保酵素具有家居清潔、凈化水體、凈化空氣、糞便及有機(jī)垃圾制肥、改良土壤等良好的環(huán)保治理效果。環(huán)保酵素的制作簡(jiǎn)單、成本低廉、能夠有效處理廚余垃圾，且環(huán)保酵素能應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，作為肥料促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，有效減少化學(xué)肥料的施用[1-8]。然而，環(huán)保酵素在放線菌、霉菌領(lǐng)域的研究資料較少，同時(shí)對(duì)酵素中促進(jìn)植物生長(zhǎng)的相關(guān)生長(zhǎng)因子檢測(cè)工作還鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究對(duì)環(huán)保酵素、食用酵素、刺梨酒為研究對(duì)象，通過(guò)其在促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面的作用，測(cè)定其細(xì)菌、放線菌、霉菌的數(shù)量和放線菌的種類(lèi)，分析放線菌種群結(jié)構(gòu)和酵素中生長(zhǎng)因子化學(xué)成分及含量，探討酵素類(lèi)產(chǎn)品用作植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑改良肥料農(nóng)用的微生物和化學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 環(huán)保酵素的制備方法

將瓜果皮、紅糖和水按1∶1∶8(250 g∶250 g∶2000 L)的比例加入3L廣口塑料罐中，密封后混勻，室溫(20～25 ℃)自然發(fā)酵。在發(fā)酵的前兩周每天開(kāi)蓋放氣一次，在發(fā)酵全程每天混勻一次；發(fā)酵1年的環(huán)保酵素：2018年12月3日制備的環(huán)保酵素裝瓶保存；食用酵素：符合現(xiàn)行的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《食用植物酵素》T/CBFIA 08003-2017，此次實(shí)驗(yàn)用的酵素以刺梨為主原料的食用酵素[9-11]。

1.2 酵素液成分分析方法

環(huán)保酵素中各相關(guān)陽(yáng)離子及酸類(lèi)含量采用離子色譜方法(IC)進(jìn)行測(cè)定：但篩選到的各離子的與生長(zhǎng)素的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。另外，本研究只是對(duì)酵素中吲哚乙酸及鐵載體做了定性測(cè)定，其產(chǎn)生機(jī)理如何，還需進(jìn)一步進(jìn)行定量測(cè)定。

1.3 培養(yǎng)基及微生物培養(yǎng)方法

真菌數(shù)量測(cè)定：采用馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基，以平板表面涂抹法計(jì)數(shù)。即稱(chēng)取土壤鮮樣10 g，在無(wú)菌條件下用無(wú)菌水配成不同濃度梯度懸浮液，取稀釋度為10-1、10-2的土壤懸浮液各50 μL，接種于盛有滅菌的馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌刮刀涂抹均勻。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，恒溫(25 ℃)培養(yǎng)5～7 d，選取每皿菌落數(shù)為15～150的1個(gè)稀釋度統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，常規(guī)方法計(jì)數(shù)、純化和保藏，以供后續(xù)分析研究[12-14]。

細(xì)菌數(shù)量測(cè)定：采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，以平板表面涂抹法計(jì)數(shù)。除恒溫(28 ℃)培養(yǎng)3 d以外，其他與放線菌的數(shù)量測(cè)定方法相同，常規(guī)方法計(jì)數(shù)、純化和保藏，以供后續(xù)分析研究。

放線菌數(shù)量測(cè)定：采用改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基，以平板表面涂抹法計(jì)數(shù)。除取稀釋度為10-3、10-4的土壤懸浮液各50 μL，接種于盛有滅菌的改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基外，其余與真菌數(shù)量測(cè)定方法相同。恒溫(28 ℃)培養(yǎng)7～10 d，按上述方法統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并計(jì)算放線菌數(shù)量。分離培養(yǎng)基：馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基、改良高氏一號(hào)、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基[15]。

純化及鑒定培養(yǎng)基：改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基。

細(xì)菌及放線菌培養(yǎng)基配制時(shí)加入75 mg/L的重鉻酸鉀，以抑制雜菌，特別是真菌菌絲的生長(zhǎng)[16]。

2 結(jié)果和分析

2.1 環(huán)保酵素的成份分析與測(cè)定結(jié)果

圖1 各實(shí)驗(yàn)對(duì)象離子含量分析酸類(lèi)(g/kg)、酸根離子(mg/L)金屬離子(mg/kg)Fig.1 Ion content analysis of each experimental object

2.2 環(huán)保酵素的微生物種類(lèi)分析

環(huán)保酵素及刺梨和土壤中的微生物群落形態(tài)，通過(guò)常規(guī)檢測(cè)方式，細(xì)菌、霉菌、放線菌通過(guò)稀釋及各鑒定培養(yǎng)基的培養(yǎng)，同時(shí)通過(guò)目測(cè)比對(duì)完成對(duì)各放線菌屬的鑒定，微生物群落結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1和圖2。

結(jié)果表明：對(duì)比土壤中的細(xì)菌數(shù)量，環(huán)保酵素(瓶裝)中的放線菌數(shù)量達(dá)到了2.2×105cfu/mL(g)的數(shù)量，其中環(huán)保酵素(桶裝)放線菌數(shù)量為1×105cfu/mL(g)，說(shuō)明發(fā)酵的時(shí)間較久的瓶裝酵素中的活性細(xì)菌物質(zhì)增長(zhǎng)較快，而用瓜果制成的食用酵素中的細(xì)菌量級(jí)為1×104的量級(jí)，食用酵素中的細(xì)菌數(shù)量較少，其原因?yàn)槭秤媒退刂械闹饕牧蠟樗凹t糖等的原生細(xì)菌的數(shù)量較少，其中刺梨酒中的細(xì)菌數(shù)量為40005cfu/mL(g)，刺梨酒因其酒精濃度達(dá)到了25°之上，其中的細(xì)菌存活環(huán)境較差。環(huán)保酵素(瓶裝)及環(huán)保酵素(桶裝)的真菌數(shù)量均為100 cfu/mL(g)，與食用酵素及刺梨酒中的真菌數(shù)量差距較大，其中環(huán)保酵素(瓶裝)放線菌數(shù)為1.2×105(cfu/mL(g))而(桶裝)放線菌數(shù)量為5600(cfu/mL(g))，其中瓶裝放線菌內(nèi)，放線菌主要通過(guò)形成無(wú)性孢子的方式進(jìn)行繁殖，也可借菌體為裂片段繁殖，其在儲(chǔ)存容器中的繁殖速度較快。

表1 各實(shí)驗(yàn)對(duì)象微生物群落結(jié)構(gòu)分析Tab.1 Microbial community structure of each experimental object

圖2 各實(shí)驗(yàn)對(duì)象微生物群落結(jié)構(gòu)培養(yǎng)圖Fig.2 Microbial community structure of each experimental object

2.3 環(huán)保酵素中促生長(zhǎng)因子的測(cè)定結(jié)果

吲哚乙酸系天然植物生長(zhǎng)素中在植物界分布最廣的，作為確定植物生長(zhǎng)素類(lèi)的作用效價(jià)的基準(zhǔn)物質(zhì)。此物質(zhì)在大腸桿菌等多數(shù)的細(xì)菌或一種根霉(Rhizopus su-inus)、酵母、玉米黑粉病菌等真菌類(lèi)中能合成[17]。

鐵載體(siderophore)是微生物產(chǎn)生的一種對(duì)Fe3+具有超強(qiáng)絡(luò)合力的低分子量有機(jī)化合物，多為八面體構(gòu)型。其生物合成受外界Fe3+含量影響，可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)。鐵載體主要存在于微生物中(細(xì)菌、真菌)，此外禾本科植物，如大麥、小麥等，也可以合成鐵載體[18-20]。微生物需要鐵元素合成細(xì)胞色素和酶類(lèi)，但產(chǎn)鐵載體根際菌能促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、增加作物產(chǎn)量、提高植物的抗逆性以及抑制根際有害菌群等作用。環(huán)保酵素原液中促生長(zhǎng)因子的存在如圖3所示。

圖3 各實(shí)驗(yàn)對(duì)象中促生長(zhǎng)因子檢測(cè)圖Fig.3 Growth factors in each experimental object

環(huán)保酵素(瓶裝)、環(huán)保酵素、食用酵素、刺梨酒中的吲哚乙酸含量分別為26 mg/L、28.7 mg/L、26.9 mg/L、34.9 mg/L，其中刺梨酒中的吲哚乙酸含量最高，其原因?yàn)榇汤嬖牧现猩L(zhǎng)素的含量較高，各酵素中的吲哚乙酸含量差別不大，酵素較玉米發(fā)酵液中的(IAA)含量(4 mg/L)高，其中各實(shí)驗(yàn)樣品均達(dá)到了生物菌肥(2.5～50 mg/L)的范圍，說(shuō)明其對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及增加作物產(chǎn)量有著明顯的作用。環(huán)保酵素(瓶裝)、環(huán)保酵素、食用酵素、刺梨酒中的鐵載體含量分別為26 mg/L、28.7 mg/L、26.9 mg/L、34.9 mg/L，刺梨酒中的鐵載體含量較高，主要為刺梨植株植物體內(nèi)合成，三種酵素的平均鐵載體含量為27.2 mg/L，鐵載體含量較高，其來(lái)源為產(chǎn)鐵載體細(xì)菌及相關(guān)代謝過(guò)程。

3 討論

由于環(huán)保酵素是成本低廉、簡(jiǎn)易可行的綠色村莊有機(jī)垃圾生物處理方式。農(nóng)村廚余垃圾制成環(huán)保酵素，以及特定功能菌如纖維素降解菌、耐酸菌、硝化菌等和酶類(lèi)物質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。本文針對(duì)環(huán)保酵素的微生物群落種類(lèi)及數(shù)量進(jìn)行了分析，放線菌菌落主要為鏈霉菌屬及假單胞桿菌屬，其中環(huán)保酵素(瓶裝)放線菌數(shù)量均達(dá)到了105數(shù)量級(jí)，其中的真菌較刺梨酒和土壤中培養(yǎng)的數(shù)量少，環(huán)保酵素和食用酵素放線菌數(shù)量均達(dá)到了105數(shù)量級(jí)，說(shuō)明環(huán)保酵素中微生物形態(tài)多樣性豐富及數(shù)量較多。同時(shí)本文也對(duì)樣品中的生長(zhǎng)素含量進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)的生長(zhǎng)素分別為吲哚乙酸和鐵載體，各酵素中的吲哚乙酸含量差別不大，酵素較玉米發(fā)酵液中的(IAA)含量高，其中各實(shí)驗(yàn)樣品均達(dá)到了生物菌肥(2.5～50 mg/L)的范圍，三種酵素的平均鐵載體含量為27.2 mg/L，鐵載體含量較高，其來(lái)源為產(chǎn)鐵載體細(xì)菌及相關(guān)代謝過(guò)程。環(huán)保酵素中各離子及酸根離子含量測(cè)定結(jié)果表明刺梨酒中的吲哚乙酸含量最高，金屬離子(鉀、鈉、鈣、鎂)均超過(guò)了100 mg/kg。