劉安莉，呂定豪，王 霞，葉 新，封 帆，曾 真，何順志

(1貴州中醫(yī)藥大學 第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；2遵義市第四人民醫(yī)院，貴州 遵義 563004；3貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

蜘蛛抱蛋屬Aspidistra，主要產(chǎn)于亞洲東部的熱帶和亞熱帶地區(qū)，在中國主要分布于廣西、貴州等長江流域以南各省區(qū)。由于其葉終年青翠，國內(nèi)外廣泛栽培作常綠盆景[1]，有20余種在民間藥用，具有活血散瘀、泄熱利尿、續(xù)傷接骨、祛風止痛及清熱止咳等功效，化學成分主含甾體皂苷，現(xiàn)代藥理具有抗菌消炎的作用[2]。其種間鑒別主要依賴于花，而其花小，生于地表面，易被它物掩蓋，開花的植株較少，花期短，帶花標本采集困難，加上自然因素的干擾，許多鑒別上的關鍵特征也會變化甚至消失，以及該屬植物營養(yǎng)器官和繁殖器官(花)變異較大，給分類研究工作帶來了很多困難。自20世紀80年代以來，該屬植物的研究備受我國植物學工作者的重視，并對其進行了形態(tài)分類學、細胞學、孢粉學、分子生物學等系列卓有成就的研究，筆者所在課題組近20年對其分類鑒定做了進一步的研究?；谄滂b定上的特殊性，本文通過整理國內(nèi)外學者對于其分類學的研究及結(jié)合本課題組的研究，從經(jīng)典分類學研究、細胞學研究、微形態(tài)研究、分子生物學及近紅外光譜研究等5個方面闡述該屬植物的分類學研究進展，為該屬分類學的進一步研究提供參考，為有效的開發(fā)利用該屬植物打下堅實的基礎。

1 經(jīng)典分類學研究

蜘蛛抱蛋屬錄屬于廣義的百合科Liliaceae，系1822年由J.Ker-Gwal.建立。1978年《中國植物志》中將國產(chǎn)該屬植物歸納為8種[1]，2000年Flora of China記載了55種[3]，2008年Tillich記錄全世界該屬植物約93種，隨著研究的深入10余年來發(fā)表了許多新種，目前全世界已經(jīng)接近170種，其中中國就有100余種[4-30]。李光照等[31-32]認為花的各部分尤其是柱頭的特征和結(jié)構(gòu)性狀較穩(wěn)定，是該屬植物系統(tǒng)演化的主要依據(jù)，而果實及根莖葉等特征和構(gòu)造雖與其演化有密切聯(lián)系，但由于其性狀變異較大，只能作為次要佐證?；谶@一原則，將該屬的分類群劃分為3組20系54種：組Ⅰ.初生組Sect.Primihenae，2種；組Ⅱ.三線組Sect.Trilineares，該組含有11系31種：系1.長圓葉蜘蛛抱蛋系Ser.Oblogifoliae，1種，系2.洞生蜘蛛抱蛋系Ser.Cavicolae，8種，系3.傘柱蜘蛛抱蛋系Ser.Fungliformes，3種，系4.小花蜘蛛抱蛋系Ser.Minutiflorae，8種，系5.廣西蜘蛛抱蛋系Ser.Retusae，2種，系6.黃花蜘蛛抱蛋系Ser.Flaviflorae，3種，系7.盈江蜘蛛抱蛋系Ser.Yingjiangenses，2種，系8.粽粑葉系Ser.Sexexcavatae，1種，系9.華南蜘蛛抱蛋系Ser.Austrosinenses，1種，系10.碟柱蜘蛛抱蛋系Ser.Acetabuliformes，1種，系11.環(huán)江蜘蛛抱蛋系Ser.Huanjiangenses(三線組Trilineares)，1種；組Ⅲ.四線組Sect.Luridae，該組含有9系21種：系1.棕葉草系Ser.Oblanceifoliae，1種，系2.廣東蜘蛛抱蛋系Ser.Luridae，3種，系3.十字蜘蛛抱蛋系Ser.Cruciformes，1種，系4.流蘇蜘蛛抱蛋系Ser.Fimbriatae，7種，系5.樂業(yè)蜘蛛抱蛋系Ser.Leyeenses，1種，系6.柳江蜘蛛抱蛋系Ser.Patentilobae，2種，系7.羅甸蜘蛛抱蛋系Ser.Luodianensis，1種，系8.巨型蜘蛛抱蛋系Ser.Longilobae，4種，系9.裂柱蜘蛛抱蛋系Ser.Quadrpartitae，1種。

目前該屬植物物種數(shù)量增加，且其物種界限比較模糊，特別是種下分類，Tillich等[33]建議將那些難以區(qū)分的種考慮為變種或為同種，建議營養(yǎng)性狀以及一些花的次要性狀不同的同地域的植株歸為變種，當兩種植株在花的性狀上有差異，且相距約100公里或更遠時(大約至少一個緯度)應歸為亞種。以此為規(guī)則，將目前公認的11個種下分類群再分類，其中3個種可被細分為2個亞種，其余8個種包含17個變種。

綜上所述，目前該屬植物的分類鑒定依據(jù)是以花的各部分特征為主，如花被與裂片形狀及其內(nèi)部特征，雄蕊著生位置，柱頭的結(jié)構(gòu)特征等，而根莖葉等結(jié)構(gòu)特征為輔助特征。

2 細胞分類學

細胞分類學是利用細胞學特征進行生物分類的學科。由于該學科的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)形態(tài)分類難以解決的問題，目前它已成為現(xiàn)代綜合分類的重要組成部分，在許多動、植物類群中，染色體數(shù)據(jù)(包括染色體數(shù)目、核型分析、染色體帶型分析、染色體組分析等)已同形態(tài)特征一樣成為標準分類的基本數(shù)據(jù)。

80年代就有學者對該屬植物進行細胞分類學研究，目前約40余種有核型分析報道[34-43]。黃錦嶺等[35]報道了13種的染色體核型。結(jié)果表明，該屬植物染色體數(shù)目2n=38或2n=36，核型皆為二型性；核型具有穩(wěn)定的隨體特征；其染色體基數(shù)應為x=18，19。王任翔等[40]對8種進行核型研究，結(jié)果表明該屬植物的染色體數(shù)目為2n=36和2n=38，各占一半。染色體數(shù)目為2n=36的種類中，其外部形態(tài)尤其是花部式樣的形態(tài)和結(jié)構(gòu)是較簡單的，可能代表其原始性狀。2n=38的類群中，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)較復雜和特化，可能代表其進化性狀。因此可認為蜘蛛抱蛋屬染色體的原始基數(shù)應為x=18，而x=19是次生基數(shù)。該屬染色體數(shù)目進化的趨勢為上升性變異。其物種形成主要在二倍體水平上進行。形態(tài)結(jié)構(gòu)的復雜特化與m型染色體數(shù)目的增加似乎相關。該屬的核型可能是向?qū)ΨQ性增強的方向演化。筆者[44]根據(jù)報道的核型資料，對其形態(tài)特征進行了總結(jié)(表1)，結(jié)果與王任翔等[40]一致。喬琴等[42]對其的染色體數(shù)目和核型進行研究分析，結(jié)果表明其核型似乎并沒有向不對稱性增強的方向演化。筆者[45]根據(jù)在貴州產(chǎn)的7個種進行了研究，結(jié)合外部形態(tài)特征，對屬內(nèi)核型進化的一些問題進行了探討，結(jié)果表明，除傘柱蜘蛛抱蛋的染色體數(shù)目為2n=36外，其余種均為2n=38。該種的核型分析與王任翔等[37]的結(jié)論一致。該種的外部形態(tài)特征與其他種有明顯差異，其特征多屬于該屬植物的原始性狀。通過各種與其近緣種比較的結(jié)果表明，形態(tài)特征與其染色體數(shù)目、核型結(jié)構(gòu)等特征具有一定的相關性，可以作為該屬植物近緣種研究的佐證。

綜上所述，該屬植物的核型結(jié)構(gòu)與其外部形態(tài)特征如根狀莖的粗細、花梗長度、花被形狀、花被裂片內(nèi)側(cè)附屬物、雄蕊著生位置、雌蕊形態(tài)、柱頭表面構(gòu)造、果實等，均具有一定的相關性，而這些外部形態(tài)是該屬植物起源進化研究以及自然分類鑒定的重要性狀，因此，對該屬植物進行細胞分類學研究可以為該屬植物起源進化研究以及自然分類鑒定提供一定的依據(jù)。

表1 染色體數(shù)目為2n=36和2n=38的植物形態(tài)特征比較Tab.1 Comparison of plant morphological characteristics withchromosome numbers of 2n=36 and 2n=38

3 微形態(tài)研究

3.1 營養(yǎng)器官與葉表皮形態(tài)

馬黎明等[46]對廣義鈴蘭族的7個屬進行了葉表皮特征的研究，結(jié)果表明該屬葉的氣孔較少，氣孔器為無規(guī)則型；葉上表面角質(zhì)不均勻加厚，形成不規(guī)則的“脊”，其角質(zhì)層的加厚方式在不同屬中不同，或同一屬中不同種之間也多少有差異。李鳳英等[47]首次對該屬9種植物的根、根狀莖和葉進行了解剖學研究以及觀察葉表皮特征，結(jié)果表明其解剖結(jié)構(gòu)基本相同。根和根狀莖都由表皮、皮層和微管柱組成。葉為等面葉，具有C4植物結(jié)構(gòu)特征；氣孔在上、下表皮均有分布，保衛(wèi)細胞腎形，屬四輪列型，該研究推翻了馬黎明等[46]認為氣孔器為無規(guī)則型的結(jié)果。該屬植物的解剖結(jié)構(gòu)與大多數(shù)濕生植物類似，與其生態(tài)環(huán)境相適應，體現(xiàn)了結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一。

由于葉片受季節(jié)和氣候的影響較小，葉表皮微形態(tài)特征(包括表皮細胞、氣孔器、表皮毛等特征)具有較高的穩(wěn)定性，具有種、屬的特異性，因此在植物分類、形態(tài)鑒定上具有重要意義[48-49]，葉表皮特征的微形態(tài)的多樣性曾用在種間、屬間甚至科的分類和系統(tǒng)演化關系方面的探討，具有重要的分類價值[50-51]。唐賽春等[52]對5種該屬植物的葉表皮和果皮的微觀形態(tài)進行了研究，研究結(jié)果表明，微觀特征與李光照等[31]報道的組系排列基本一致，表明微觀特征對于疑難種的鑒定和合理進行屬下分類有重要的分類學參考價值。王任翔等[53]觀察9種該屬植物的葉表皮微形態(tài)，結(jié)果表明其主要特征是相同的，氣孔大小與染色體的倍性有一定的正相關關系，不同種間葉表皮特征表現(xiàn)出一定差異，對種的劃分有一定的分類鑒定意義。

3.2 孢粉學研究

孢粉學是研究植物的孢子、花粉的形態(tài)、分類的科學。花粉的形態(tài)受植物核基因的控制，是基因型的外在表現(xiàn)，又不受外界條件的影響，具有高度穩(wěn)定性，因此為研究植物的系統(tǒng)發(fā)育、演化關系提供了可靠的依據(jù)[54]。不同孢粉的萌發(fā)器官的數(shù)目、位置、特征各不相同，是鑒定及分類的重要特征。對花粉形態(tài)和表面紋飾的研究，有助于解決種的分類問題。

馬黎明等[46]對鈴蘭族的7個屬進行了花粉形態(tài)的研究，結(jié)果表明蜘蛛抱蛋屬為無萌發(fā)孔的球形花粉，外壁紋飾很復雜，常為各式的瘤狀紋飾。其花粉形態(tài)顯然不同于開口箭屬和萬年青屬，這與Nakai[55]對這3個屬形態(tài)研究的結(jié)論一致。在該屬的部分種中，花的外部形態(tài)的演化與其花粉外壁紋飾的演化呈正相關性。

黃錦嶺等[56]研究并報道了蜘蛛抱蛋亞族的花粉形態(tài)，結(jié)果表明，蜘蛛抱蛋亞族中最原始的花粉類型為單槽橢圓形，具孔狀或網(wǎng)狀外壁紋飾。其中蜘蛛抱蛋屬為球形，無萌發(fā)孔，外壁具皺波狀、瘤狀或芽孢狀紋飾的花粉為派生類型。蜘蛛抱蛋亞族種下花粉形狀、萌發(fā)孔類型和外壁紋飾基本穩(wěn)定，可作為分種特征。王任翔等[57]對14種該屬植物的花粉形態(tài)進行了觀察，該屬植物的花粉形態(tài)有長球形和球形2種；外壁紋飾可分為3大類型：皺波狀紋飾、小芽孢紋飾、瘤棒狀紋飾；它們的演化趨勢是：皺波狀紋飾→芽孢狀紋飾→瘤棒狀紋飾。

筆者所在課題組高永躍等[58-59]對14種貴州產(chǎn)該屬植物的花粉形態(tài)進行了研究，結(jié)果顯示不同種的花粉形態(tài)幾乎相似，說明花粉形態(tài)為該屬植物的共同特征且比較穩(wěn)定；小花蜘蛛抱蛋與長梗蜘蛛抱蛋的花粉表面紋飾與王任翔等[57]報道的相同。其花粉表面紋飾特征可以作為貴州產(chǎn)該屬植物的鑒別依據(jù)。通過觀察發(fā)現(xiàn)其花粉形態(tài)大多存在凹陷等不飽滿問題，發(fā)育不完全或者中途就停止發(fā)育的花粉不能受精結(jié)果，解釋了其為何只見開花而結(jié)果甚少的現(xiàn)象。研究還表明新種貴州蜘蛛抱蛋A.guizhouensis[22]的花粉特征與其近緣種區(qū)別較大，為其作為新種又提供了一個重大佐證。

綜上所述，蜘蛛抱蛋屬植物種間葉表皮主體特征相同，不同種間有其個性差異，氣孔大小與染色體的倍性有一定的正相關關系，在該屬植物分類和形態(tài)鑒定上具有重要意義；其花粉粒的形態(tài)特征較為穩(wěn)定，其演化過程與花的外部形態(tài)的演化程度正相關，因此其既可為該屬植物的鑒別與系統(tǒng)演化研究提供一個較為重要的依據(jù)，也具有一定的分類學意義。

4 分子生物學研究

生物的各種性狀主要是由遺傳物質(zhì)DNA決定的，由于其不受外界因素、個體形態(tài)特征、發(fā)育階段以及完整性的影響，可以從基因水平上提供鑒定的依據(jù)，準確地辨別傳統(tǒng)分類學中難以區(qū)分的物種，甚至可以對種下等級進行鑒定。目前DNA分子鑒定在動植物分類、物種鑒別等領域備受關注。王川易等[60]把中藥材DNA分子鑒定技術分為了3大類：基于序列分析的DNA鑒定技術(如DNA條形碼技術等)；基于PCR擴增的DNA指紋鑒定技術(如RAPD和ISSR等)；基于分子雜交的DNA鑒定技術(如RFLP和DNA芯片技術等)。唐紹清等[61]首次采用克隆測序的方法，測定8種蜘蛛抱蛋屬植物的核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列，經(jīng)對位排列后91個位點對于簡約分析是有效的信息位點，對于蜘蛛抱蛋屬的分子系統(tǒng)學研究，ITS區(qū)是段很有價值的DNA片段。黃海等[62]從不同地區(qū)采集的5株該屬植物，采用克隆測序法對其ITS序列進行測定，截取ITS1進行比較，測序結(jié)果表明，在該區(qū)域有121個變化位點，說明該植物的ITS1區(qū)是一個堿基高變區(qū)域，這與唐紹清等[42]報道的結(jié)果相符。該植物在不同采集點之間的ITS序列存在差異，特別是在ITS1區(qū)域之間的變異引起序列堿基的差異，提示ITS1序列能夠為該屬植物的分類和鑒定提供較為豐富的信息位點，適用于種間系統(tǒng)發(fā)育分析。

DNA條形碼技術是通過比較物種中的一條或少數(shù)幾條通用的DNA片段對物種進行快速、準確鑒別的一項新技術。它是通過對所獲得的一條或幾條DNA片段進行大范圍的掃描，構(gòu)建DNA條形碼標準數(shù)據(jù)庫[63]，從而鑒定某個未知的物種或發(fā)現(xiàn)新種，它能夠提供簡便、快速、可信的分類依據(jù)。筆者[44，64]通過評價該屬11個種的6個分子標記的鑒定能力，結(jié)果顯示，多序列組合matK+psbK-psbI的鑒定成功率達到100%，該組合可用于該屬植物的鑒定。本課題組呂定豪等[65-66]增大樣本量進一步對19種104批樣品的matK、psbA-trnH、psbK-psbI和rbcL等候選序列進行鑒定效率評價，結(jié)果顯示，matK+psbK-psbI組合的鑒定成功率為100%，基于該序列組合構(gòu)建蜘蛛抱蛋屬植物的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示同一物種的樣品聚集度較好，多表現(xiàn)為單系。說明該序列組合可作為蜘蛛抱蛋植物種鑒定的最佳條形碼序列。

黃丹妮等[67-68]對20種該屬植物的RLCKⅦ基因進行了測序分析，結(jié)果表明，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育關系不支持先前基于形態(tài)證據(jù)所建立的分類系統(tǒng)；各物種都有各自獨特的變異，故RLCKⅦ基因能夠區(qū)分已知物種，RLCKⅦ基因可作為研究單子葉植物系統(tǒng)發(fā)育關系的備選基因。黃丹妮等[68]通過分析葉綠體基因trnL-F、rbcL、rpl16、trnK，核糖體基因ITS，核基因RLCKⅦ、MS、RPB2、GLO-like的序列變異，結(jié)果表明，基于葉綠體基因分子鐘的推測，該屬植物的分化時間應小于10個百萬年，是一個快速產(chǎn)生大量物種的典型類群；其系統(tǒng)樹雖然整體上呈輻射狀結(jié)構(gòu)，但仍有一些支持率較高的分支，可以用來探討某些物種間的親緣關系，如采自臺灣的樣品很可能來自蜘蛛抱蛋A.elatior；用二代測序法(NGS)測定了石山蜘蛛抱蛋A.saxicola的花部轉(zhuǎn)錄組，獲得了大量的備選SSR位點，并開發(fā)了一套適用于不同該屬植物的微衛(wèi)星標記，有助于了解該屬植物的譜系分布格局和現(xiàn)有類群間的系統(tǒng)發(fā)育關系。

綜上所述，該屬植物在分子生物學方面的研究初見成效，從分子層面對其進行研究，規(guī)避形態(tài)分類鑒定的缺陷，不僅能夠鑒定疑難物種，還能為訂立新種提供有力證據(jù)，其系統(tǒng)發(fā)育的研究將為物種的適應性和繁殖模式等提供關鍵信息，對該屬植物野外種群的保護具有積極的意義。近年來該屬植物的數(shù)量不斷增加，因此尚需進一步對其進行分子生物學的研究，構(gòu)建該屬的分子鑒定系統(tǒng)，使得該方法更加成熟有效。

5 近紅外光譜研究

近紅外光譜(NIRS)技術是近年來發(fā)展迅速的操作簡便、分析速度快、精確度高和綠色的分析技術。在藥用植物鑒定領域越來越受到關注和應用，由于不同藥用植物種或分類群所含化學成分的種類和含量存在綜合性差異，必然表現(xiàn)出NIRS的差異性。高永躍等[59，69]首次對23批該屬植物進行NIRS研究，結(jié)果表明其近紅外圖譜相似程度極高，具有一定的專屬性，可以為其分類鑒定提供一種新方法。呂定豪等[66]增加樣品量與擴大采樣范圍采用該技術對42批該屬植物進行研究，結(jié)合外部形態(tài)、孢粉學及細胞分類學研究成果對分析結(jié)果進行探討，驗證了NIRS用于該屬植物鑒定是合理的。這也為該屬植物的鑒定研究提供了化學分類依據(jù)。

綜上所述，目前從該屬植物中提取得到的化學成分主要是甾體皂苷[70-74]，而甾體類物質(zhì)中含有C-H，N-H，O-H等物質(zhì)，能產(chǎn)生近紅外光譜，理論上該項技術是適用于該屬植物的研究。而通過對該屬植物的相關研究，結(jié)果具有專屬性，說明該技術對于該屬植物的分類鑒定是有意義的，為該屬的分類建立了一種準確、快速、綠色的新方法。

6 結(jié)語與展望

中藥鑒定是保證準確合理用藥的關鍵環(huán)節(jié)，也是中藥質(zhì)量控制的首要環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)的鑒定方法由于常受到環(huán)境及自身生長發(fā)育的影響，鑒定時存在局限。近年來新種報道甚多，新種多依據(jù)傳統(tǒng)分類方法，由于該屬植物鑒定上的特殊性，沒有其他分類鑒定方法的輔助研究，缺少了其作為新種的支撐依據(jù)，這也導致一些學者對于新種的質(zhì)疑。通過本文綜述表明，細胞分類學、葉表皮微形態(tài)、孢粉學、分子生物學及近紅外光譜研究對該屬植物均具有分類學意義，對于該屬提供分種依據(jù)，能鑒別疑難物種和輔助種間甚至于種下鑒定，為研究其起源進化和系統(tǒng)發(fā)育為物種的適應性和繁殖模式等提供關鍵信息。蜘蛛抱蛋屬植物喜生于茂密陰濕、土壤肥沃的常綠闊葉林，由于自然環(huán)境的因素及人為的破壞，部分種類已經(jīng)瀕臨滅絕，加之該屬植物是一個大類群，對該屬植物的相關研究任重而道遠，需要更進一步的研究，以求建立一套準確、快速、綠色的分類鑒定方法，為有效的開發(fā)利用該屬植物與保護其野外種群打下堅實的基礎。