江津津,謝佩樺,任 芳,賴梓健,歐愛芬

(1.廣州城市職業(yè)學(xué)院食品系,廣東廣州 510405;2.濟(jì)南海能儀器股份有限公司 山東濟(jì)南 250061)

柑普茶是將新會(huì)茶枝柑的果肉掏空、生曬、填入普洱茶后,再蓋上揭掉的柑皮蓋,風(fēng)干收縮特制而成的一種茶[1]。它融合了新會(huì)柑皮(陳皮)濃烈的果皮香味和云南普洱茶醇厚甘香之味,讓陳皮與普洱相互融合,兼具新會(huì)陳皮和普洱茶的功效[2]。

長期以來,感官品評(píng)都是評(píng)定茶葉品質(zhì)優(yōu)劣的重要方法,但該方法需要有豐富的茶學(xué)知識(shí)和審評(píng)經(jīng)驗(yàn)[3]。普通消費(fèi)者很難分辨茶葉質(zhì)量的優(yōu)劣,而且感官的靈敏度也易受到外界因素的干擾,從而影響評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性、客觀性與一致性[4-5]。氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)融合了氣相色譜突出的分離特點(diǎn)和離子遷移譜快速響應(yīng)、高靈敏度的優(yōu)勢(shì),在食品風(fēng)味分析的應(yīng)用上受到了廣泛的關(guān)注[6-10]。氣相離子遷移譜(Gas Chromatography-Ion Mobility Spectrometry,GC-IMS)獲得的三維矩陣(遷移時(shí)間、保留時(shí)間和離子強(qiáng)度)能提供更加豐富的化學(xué)信息,適用于更高級(jí)的數(shù)據(jù)處理[11]。目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于食品、中藥、煙草、酒類、農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)藥、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域[12]。不僅可以進(jìn)行食品風(fēng)味分析還可以通過檢測(cè)目標(biāo)化合物來控制產(chǎn)品質(zhì)量,甚至可以對(duì)環(huán)境水樣中多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等污染物進(jìn)行分析和毒理學(xué)分析,但針對(duì)柑普茶這種有濃郁獨(dú)特氣味的特色茶的風(fēng)味分析應(yīng)用的研究還不多見。本研究主要利用氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)和風(fēng)味分析領(lǐng)域常用的頂空-固相微萃取聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)對(duì)新會(huì)茶枝柑制得的柑普茶進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味和化合物分析,以期為新會(huì)柑普茶的風(fēng)味研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柑普茶 廣東新會(huì)茶枝柑柑果(新會(huì)區(qū)三江鎮(zhèn)聯(lián)合村老良圍一車間)與云南普洱(勐海產(chǎn))制得,制作工藝簡述如表1。

表1 新會(huì)柑普茶與橘紅普洱的工藝Table 1 Samples and technology of Xinhui citrus Pu tea and tangerine Pu’er

FA1004N電子分析天平、CU-600電熱恒溫水槽 上海精密儀器儀表有限公司;CX-200A型中藥粉碎機(jī) 上海晟喜制藥機(jī)械有限公司;TG16臺(tái)式高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;XT-NS1全自動(dòng)氮吹濃縮儀 上海新拓分析儀器科技有限公司;Agilent 6890N-5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 安捷倫科技有限公司;PDMS/DVB固相微萃取萃取頭 上海楚定分析儀器有限公司;Checkmate 3頂空分析儀 丹麥Densensor公司;Flavour Spec氣相離子遷移譜聯(lián)用儀 德國G.A.S有限公司,內(nèi)置500 V/cm電場強(qiáng)度、300 MBq輻射氚(H3)、5 kV漂移電壓、98 mm遷移管的IMS標(biāo)準(zhǔn)模塊,厚度為0.2 μm,FS-SE-54-CB-115 m ID:0.53 mm氣相色譜多毛細(xì)管柱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 T1、T2、T3、T4和T5五組樣品分別放入中藥粉碎機(jī)中粉碎并混合均勻,精確稱取1.00 g已均勻粉碎的樣品,在頂空樣品瓶用沸水(料液比l:6 g/mL)沖泡后立即封口。

1.2.2 GC-IMS檢測(cè)條件 頂空孵化溫度80 ℃、孵化時(shí)間10 min,孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。載氣為高純氮?dú)?≥99.999%),色譜柱溫度40 ℃、色譜運(yùn)行時(shí)間50 min,載氣的流速梯度設(shè)置為5.00 mL/min保持2 min,在10 min內(nèi)線性增至50.00 mL/min,在10 min內(nèi)線性增至150.00 mL/min后保持30 min。頂空進(jìn)樣針溫度85 ℃、進(jìn)樣量300 μL[5]。

1.2.3 HS-SPME-GC-MS檢測(cè)條件 SPME條件:65 μm PDMS/DVB固相微萃取頭(實(shí)驗(yàn)前在氣相色譜進(jìn)樣口250 ℃的條件下老化5 min)在60 ℃條件下平衡5 min,吸附30 min,最后解吸附3.5 min。

GC-MS條件:彈性石英毛細(xì)管柱(HP-5柱,30 m×0.25 mm×0.25 μm),進(jìn)樣口溫度:250 ℃,ECD檢測(cè)器溫度:250 ℃,載氣:高純氦氣(純度>99.999%),流速:1.0 mL/min,柱溫:起始50 ℃,保持5 min,隨后3 ℃/min升至125 ℃,保持3 min,隨后以2 ℃/min升至180 ℃,柱溫180 ℃,保持3 min;最后以15 ℃/min升至230 ℃。分流比為50∶1。離子源EI,離子源溫度230 ℃,電子能量70 eV,發(fā)射電流34.6 μA,四極桿溫度150 ℃,轉(zhuǎn)接口溫度:280 ℃,電子倍增器電壓350 V,質(zhì)量掃描范圍:35～400 amu[3]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

儀器配套的分析軟件包括LAV(Laboratory Analytical Viewer)和三款插件以及GC×IMS Library Search,不同的分析軟件有不同的分析方向:LAV用于查看分析譜圖,圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物;對(duì)其建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后可進(jìn)行定量分析;Reporter插件直接對(duì)比樣品之間的譜圖差異(二維俯視圖和三維譜圖);Gallery Plot插件指紋圖譜對(duì)比,直觀且定量地比較不同樣品之間的揮發(fā)性有機(jī)物差異;Dynamic PCA插件動(dòng)態(tài)主成分分析,用于將樣品聚類分析,以及快速確定未知樣品的種類;GC×IMS Library Search應(yīng)用軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行二維定性分析,用戶可根據(jù)需求利用標(biāo)準(zhǔn)品自行擴(kuò)充數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 Reporter插件直接對(duì)比橘紅普洱、胎柑與柑普茶中揮發(fā)性有機(jī)物的差異

2.1.1 直接對(duì)比橘紅普洱及柑普茶中揮發(fā)性有機(jī)物的差異 圖1背景為藍(lán)色,橫坐標(biāo)1.0處紅色豎線為RIP峰(反應(yīng)離子峰,經(jīng)歸一化處理),由圖1可以直觀的看出,T5-1(橘紅普洱)的揮發(fā)性化合物與T2-1、T3-1、T4-1(柑普茶)之間有明顯差異。橘紅普洱中揮發(fā)性有機(jī)物的種類的含量相比柑普茶少,點(diǎn)的個(gè)數(shù)和顏色比后三者少且淺;T2～T4圖中圈出的物質(zhì),隨著小青柑的生長期不同,部分揮發(fā)性有機(jī)物消失(點(diǎn)的個(gè)數(shù)少了),部分揮發(fā)性有機(jī)物含量降低(點(diǎn)的亮度淺了),具體所指的揮發(fā)性有機(jī)物見指紋圖譜。定性分析結(jié)果和感官分析結(jié)果也顯示普洱和柑普茶中的風(fēng)味物質(zhì)存在顯著的差異。

圖1 橘紅普洱與柑普茶中的揮發(fā)性有機(jī)物差異對(duì)比Fig.1 Comparison of volatile organic compoundsin tangerine Pu’er and citrus Pu tea

2.1.2 直接對(duì)比胎柑及柑普茶中揮發(fā)性有機(jī)物的差異 圖2直接對(duì)比了胎柑及3種柑普茶中揮發(fā)性有機(jī)物的差異,圖2中圈出的揮發(fā)性有機(jī)物含量在胎柑(T1)及普柑茶(T2、T3、T4)中各不相同,原因?yàn)樾聲?huì)柑柑皮在不同成熟期,揮發(fā)性有機(jī)物含量存在差異。柑普茶中揮發(fā)性有機(jī)物的總體含量少于胎柑(T1),胎柑是每年3～4月采摘的新會(huì)柑幼果干燥制成的,在新會(huì)茶枝柑植株的第一次生理落果期前摘取,屬胎果,個(gè)頭小小的,里面還沒有長肉,也不含普洱茶的成分。胎柑保留了絕大部分的柑油(揮發(fā)油95%以上)成分,因此其風(fēng)味非常強(qiáng)烈,揮發(fā)性化合物更為豐富。由圖2可見,從同株茶枝柑植株上采摘的不同成熟期的柑果的皮在制成柑普茶之后,所含的特征揮發(fā)性有機(jī)物的含量有明顯差異,也可以據(jù)此來判斷柑普茶的類別。

圖2 胎柑與柑普茶中的揮發(fā)性有機(jī)物差異對(duì)比Fig.2 Comparison of VOCs incitrus embryo and citrus Pu tea

2.1.3 直接對(duì)比小青柑、青柑和二紅柑中揮發(fā)性有機(jī)物的差異 圖3比對(duì)了T2小青柑、T3青柑和T4二紅柑的揮發(fā)性有機(jī)物的差異,由圖3可見,三類樣品的揮發(fā)性有機(jī)物相似,但含量明顯不同。T2～T4中,青柑的成熟度(生長周期)不同,則所含的揮發(fā)性有機(jī)物的種類與含量不同,導(dǎo)致三類樣品中揮發(fā)性有機(jī)物的種類和含量不同。例如:異丁醛Isobutanal在T2樣品中含量最高,隨著柑的成熟,該物質(zhì)的含量逐漸降低,且在T4二紅柑樣品中消失;丙基甲基酮在T2樣品中含量最低,隨著柑的成熟,該物質(zhì)的含量逐漸升高。

圖3 三類柑普茶中的揮發(fā)性有機(jī)物差異對(duì)比Fig.3 Comparison of volatile organic compoundsin three types of citrus Pu tea

2.2 Gallery Plot插件分析樣品中的揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜

橘紅普洱、柑普茶及胎柑樣品中的揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜如圖4所示,為了找尋規(guī)律,選取樣品間變化規(guī)律明顯的揮發(fā)性有機(jī)物放大顯示,由圖4a可以看出,區(qū)域B標(biāo)出的物質(zhì)可視為橘紅普洱的指紋圖譜,代表性化合物包括戊醛、己醛、環(huán)己酮等;但新會(huì)柑普茶中該類物質(zhì)的含量較少,區(qū)域B中的2-己烯-1-醇、苯乙醛等化合物在柑普茶樣品中有出現(xiàn)且含量隨著柑果的成熟而增加。上述化合物在胎柑(T1)中均不存在,說明這些化合物可能源于普洱茶的風(fēng)味。圖4b為截取的胎柑的特征指紋峰,大約有50種化合物,如芳樟醇、α-蒎烯、1-丙醇、2,6-二甲氧基苯酚等,此類化合物可被認(rèn)為是T1的特征風(fēng)味化合物。由圖4c可知,區(qū)域B標(biāo)出的物質(zhì)隨著新會(huì)柑柑果的成熟,在樣品中的含量逐漸增加,如編號(hào)為1～18的化合物,這些揮發(fā)性化合物包括α-蒎烯、檸檬烯、芳樟醇、苯乙基醋酸酯、3甲基-丁醛等。含量增加的原因極可能是隨著柑果的成熟,柑皮表面積增加[13],源于柑皮的特征性揮發(fā)性化合物含量也隨之增加。上述揮發(fā)性有機(jī)物在橘紅普洱中含量極低,可初步判斷該類物質(zhì)的來源為新會(huì)柑的柑皮。

圖4 橘紅普洱及柑普茶的整體揮發(fā)性有機(jī)物分析的部分指紋譜圖Fig.4 Partial fingerprints of volatile organic compounds in citrus Pu tea and tangerine Pu’er

由圖4d可知,區(qū)域A為柑普茶T4二紅柑的特征指紋峰,其中區(qū)域A標(biāo)出的物質(zhì)在T4樣品中含量最高,該類物質(zhì)在不同成熟期制得的柑普茶中含量不同,是影響柑普茶風(fēng)味的關(guān)鍵。這類物質(zhì)包括α-蒎烯、1-辛烯醇、苯乙基醋酸酯和2,6二氯苯酚等,其形成機(jī)理與新會(huì)茶枝柑的成熟過程的相關(guān)性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。由圖4e可見,區(qū)域A所含物質(zhì)在青柑茶T3中含量最高,與T2和T4兩個(gè)樣品一樣,這部分化合物源于新會(huì)柑皮的貢獻(xiàn),也是影響柑普茶風(fēng)味的主要因素。A區(qū)域標(biāo)注出的物質(zhì)2-苯乙醇、圖中的5～36號(hào)化合物在T5橘紅普洱樣品中含量非常高,在其他樣品中的含量非常少;B區(qū)域標(biāo)出的物質(zhì)在T5橘紅普洱中含量最高,而在青柑樣品中含量非常低,如異丁醛、丙基甲酮、乙基甲酮、環(huán)己酮、己醛、戊酸乙酯、2-己-1-醇、環(huán)己酮、丁酸乙酯等物質(zhì)。3-甲基丁烷、芳樟醇、α-蒎烯、3-己烯醇、1-丙醇、苯甲醛、丙酸乙酯、2,3-戊二酮等物質(zhì)在小青柑中含量非常高。異丁醛、乙基甲酮、2,3-戊二酮等物質(zhì)在T2中含量最高,隨著柑的成熟,該物質(zhì)的含量逐漸降低,且在(二紅柑)T4樣品中消失;乙酸乙酯、2,6-二氯苯酚等物質(zhì)在(青柑)T3樣品中含量最高,在其他兩種茶中的含量非常低;丙基甲酮、3-甲基丁醛、戊醇等物質(zhì)在小青柑樣品T2中含量最低,隨著柑的成熟,該物質(zhì)的含量逐漸升高。

2.3 橘紅普洱、柑普茶及胎柑的聚類分析(動(dòng)態(tài)主成分PCA分析)

運(yùn)用PCA插件做樣品的聚類分析,結(jié)果如圖5所示,橘紅普洱、胎柑及柑普茶分別聚成三類,其中柑普茶(T2、T3、T4)自聚在一起,3組柑普茶樣品的氣味較為相近,與橘紅普洱(T5)和胎柑(T1)的差異較大。取柑普茶樣品再進(jìn)行PCA分析如圖6。由圖6可知,三類柑普茶(T2、T3、T4)的揮發(fā)性風(fēng)味仍然存在明顯差異,氣相離子遷移譜技術(shù)可針對(duì)不同品種的柑普茶進(jìn)行快速分類鑒別。

圖5 普洱、柑普茶及胎柑的PCA分析Fig.5 PCA analysis of Pu’er,citrus Pu tea and citrus embryo

圖6 三類柑普茶的聚類分析Fig.6 Cluster analysis of citrus Pu tea

2.4 GC-IMS對(duì)樣品的揮發(fā)性有機(jī)物的定性結(jié)果

由表2可見,三類柑普茶(T2、T3、T4)中的風(fēng)味物質(zhì)的含量,即特征揮發(fā)性有機(jī)化合物的含量隨新會(huì)柑的成熟期不同而不同。T1中沒有檢測(cè)出辛醛、2-乙酰氟鈾、戊酸乙酯、環(huán)己酮、乙酸丁酯、戊醛、2-戊酮成分,而這些成分均在T2～T5樣品中有檢出。這些揮發(fā)性有機(jī)物在胎柑T1中含量幾乎不存在,可初步判斷這類物質(zhì)源于普洱茶的風(fēng)味貢獻(xiàn)[14-16]。3-甲基丁酸、1-己醇、苯乙醛是T1、T2的特征風(fēng)味物質(zhì)。二甲基二硫醚只存在于T1、T2、T3樣品中。T1～T4含有T5沒有檢測(cè)出來的風(fēng)味物質(zhì),分別為:芳樟醇、2-己醇、(Z)-3-己烯-1-醇、α-松油醇、香蘭素、β-蒎烯,而且,這類風(fēng)味化合物隨著新會(huì)柑的成熟,含量在逐漸減少直至消失。

表2 樣品的揮發(fā)性有機(jī)物定性結(jié)果Table 2 Qualitative analysis of volatile organic compounds in samples

丁香酚、2-庚酮、2-甲基吡嗪、丙酸乙酯、丙烯酸乙酯是T1的特征風(fēng)味化合物,初步認(rèn)為這些風(fēng)味物質(zhì)只存在胎柑。4-甲基-2-戊酮為T2樣品的特征風(fēng)味物質(zhì);丁醛、2-乙基呋喃為T2、T3的特征風(fēng)味物質(zhì)。根據(jù)此類特征性有機(jī)物,可判斷新會(huì)柑普茶的品種。

2.5 HS-SPME-GC-MS分析結(jié)果

運(yùn)用HS-SPME-GC-MS對(duì)樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行定量分析,揮發(fā)性化合物組成如表3所示。

表3 樣品的揮發(fā)性成分組成Table 3 Composition of volatile components in samples

由表3可以看出,樣品揮發(fā)性成分組成以酯類、醇類和碳?xì)浠衔餅橹鳌８烫?T1)含有41.45%的碳?xì)浠衔?其中21.60%為烯烴類),21.35%酯類,17.57%酚類,12.27%醇類,3.79%雜氧化合物,醛類、酮類、酸類和含氮化合物含量相對(duì)較少。小青柑(T2)含有42.17%的酯類,20.54%醇類,13.73%酚類,7.79%的碳?xì)浠衔?其中4.74%為烯烴類),5.80%雜氧化合物,醛類、酮類、酸類和含氮化合物含量相對(duì)較少。青柑(T3)含有42.16%的酯類,24.40%的碳?xì)浠衔?其中20.79%為烯烴類),10.42%醇類,8.15%酚類,5.58%酸類,3.40%雜氧化合物,醛類、酮類和含氮化合物含量相對(duì)較少。二紅柑(T4)含有37.70%的酯類,18.76%的碳?xì)浠衔?其中10.86%為烯烴類),12.29%醇類,6.39%酸類,5.32%雜氧化合物,4.60%酮類,醛類和含氮化合物含量相對(duì)較少。橘紅普洱(T5)含有49.08%的碳?xì)浠衔?其中1.81%為烯烴類),12.59%的酯類,9.37%酸類,8.68%雜氧化合物,6.61%酮類,4.78%含氮化合物,3.92%醇類,醛類和酚類含量相對(duì)較少。樣品主要揮發(fā)性成分為檸檬烯、γ-松油烯、2-甲基氨基-苯甲酸甲酯、蒎烯、松油醇、N一甲基鄰氨基苯甲酸甲酯、鄰傘花烴和1,2,3-三甲氧基苯等,這個(gè)結(jié)果與之前的GC-IMS 分析結(jié)果相一致,與前人對(duì)普洱茶風(fēng)味和陳皮風(fēng)味化合物的研究結(jié)論也較為吻合[17-19]。

3 結(jié)論與討論

使用氣相色譜-離子遷移譜技術(shù),在無需真空的前提下,經(jīng)頂空進(jìn)樣后可快速檢測(cè)柑普茶中的揮發(fā)性有機(jī)物。樣品的特征指紋峰因新會(huì)柑皮所處的成熟期不同而發(fā)生變化,有些物質(zhì)含量減少,如戊醛(Pentanal)、己醛(Hexanal)、環(huán)己酮(Cyclohexanone)等,有些物質(zhì)含量隨著柑皮的生長期的增加逐漸增多,如2-己烯-1-醇(2-Hexen-1-ol)、苯乙醛(Benzenacetaldehyde)等,可根據(jù)此類物質(zhì)的相對(duì)含量判斷柑皮所處的成熟期,從而對(duì)新會(huì)柑普茶進(jìn)行快速分類鑒別。芳樟醇、α-松油醇、香蘭素、α-蒎烯等化合物是柑普茶區(qū)別于其他普洱茶的特征風(fēng)味化合物。HS-GC-MS的分析結(jié)果顯示樣品的揮發(fā)性成分組成中以酯類、醇類和碳?xì)浠衔餅橹?分析結(jié)果與GC-IMS的分析結(jié)果相輔相成。柑普茶揮發(fā)性風(fēng)味成分以酯類、碳?xì)浠衔锖痛碱悶橹?主要揮發(fā)性成分為檸檬烯、γ-松油烯、2-(甲基氨基)-苯甲酸甲酯、松油醇、N一甲基鄰氨基苯甲酸甲酯、鄰傘花烴和1,2,3-三甲氧基苯等,其香氣成分來自柑普茶的柑皮和普洱熟茶,兼?zhèn)涠叩南銡馓卣鳌Ｍㄟ^建立柑普茶的PCA模型,可以快速鑒別柑普茶的類別及品質(zhì)。若能完善進(jìn)一步完善GC-IMS的數(shù)據(jù)庫的VOCs信息,并將分析結(jié)果與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法結(jié)合[20],則更有利于探明不同種類柑普茶的活性化合物。