李 娟,鐘平娟,萬仁口,鄧澤元,范亞葦

(南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047)

蕎麥(FagopyrumesculentumMoench)是蓼科蕎麥屬一年生草本植物,在中國大部分地區(qū)均廣泛種植,已有2000多年的栽培歷史,年均產(chǎn)量約為60～70萬噸[1]。蕎麥蜂花粉是蕎麥的主要農(nóng)副產(chǎn)品之一,是蜂蜜從蕎麥的花藥中采集花粉粒并混合自身唾液、花蜜等腺體分泌物,經(jīng)過儲存和發(fā)酵后形成的花粉團[2]。蜂花粉中含有多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì),被稱為“濃縮的天然營養(yǎng)庫”[3]。豐富的蕎麥資源也使蕎麥蜂花粉同樣具有穩(wěn)定高產(chǎn)量,蕎麥蜂花粉的開發(fā)利用前景是十分廣闊。

蕎麥蜂花粉含有豐富的碳水化合物,約占干重63.9%[4],主要為可溶性糖和多糖。多糖是一類由糖苷鍵連接而成、結(jié)構(gòu)復雜的生物活性物質(zhì),具有抗氧化、抗腫瘤[5]、抗輻射[6]、降血脂[7]、降血糖[8]、提高免疫力[9]等生理功能。蜂花粉多糖因其花粉品種、產(chǎn)地及采收時間等因素的不同使得多糖在組成、結(jié)構(gòu)及活性功能等方面存在差異性[10]。目前對于蜂花粉多糖的研究主要集中在油菜、紅花及山楂等蜂花粉品種上,對上述蜂花粉多糖結(jié)構(gòu)及功能方面的研究已有報道[11-14]。目前對蕎麥蜂花粉多糖的研究主要集中在多糖提取和功能活性上,對其多糖結(jié)構(gòu)組成的深入研究甚少。以往研究者[15]從蕎麥蜂花粉中提取分離得到三種多糖組分,僅對多糖分子量及單糖組成進行測定,采用凝膠柱層析法測定多糖分子量,峰形寬且亂,對多糖的結(jié)構(gòu)分析還不夠深入。

本研究以蕎麥蜂花粉為原料,從中提取粗多糖并對其進行分離純化。通過高效液相色譜、氣相色譜,紫外光譜及紅外光譜等技術(shù)對蕎麥蜂花粉多糖組分結(jié)構(gòu)進行進一步的分析鑒定。以期為今后蕎麥蜂花粉多糖的深入研究和蕎麥蜂花粉資源的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕎麥蜂花粉 購自山西蜂農(nóng);考馬斯亮藍G-250 生興生物技術(shù)有限公司;DEAE-Cellulose52 索萊寶生化科技有限公司;葡聚糖系列標準品(分子量分別為4320、12600、73800、496000、990000、3750000)、間羥基聯(lián)苯、半乳糖醛酸、L-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖等標準品 上海阿拉丁生化科技有限公司;苯酚、硫酸、無水乙醇、三氟乙酸、鹽酸羥胺,吡啶、乙酸酐等試劑 均為國產(chǎn)分析純。

TDL-5-A臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;Bio-Tek酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;L6S型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;1260高效液相色譜儀、Agilent 6890N氣相色譜儀 美國Agilent公司;Nicolet 5700智能型傅里葉變換紅外光譜儀 美國熱電尼高力公司;JSM 6701F場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀 日本電子儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂花粉表觀形態(tài)觀察 采用超微粉碎機對蕎麥蜂花粉進行破壁處理,粉碎功率為850 W,電機轉(zhuǎn)速為25000 r/min,破壁后過60目篩備用,通過掃描電鏡觀察以分析蜂花粉破壁前后情況。取少量破壁前后的蕎麥蜂花粉均勻的平鋪于掃描電鏡的載物臺上,離子濺射儀鍍金1 min后,采用場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀對蕎麥蜂花粉表觀形態(tài)進行觀察并拍照。

1.2.2 多糖的提取 稱取適量破碎完全的蕎麥蜂花粉于錐形瓶中,按料液比1∶4 g/mL加入90%的乙醇溶液,置于50 ℃水浴下回流脫脂1 h。脫脂后加入10倍量的去離子水浸泡12 h,而后置于85 ℃恒溫水浴下,震蕩浸提4 h,離心(4500 r/min,10 min)取上清液,取離心后沉淀重復浸提操作三次。合并提取液,減壓濃縮至300 mL入4倍體積的無水乙醇,醇沉24 h后離心取沉淀,經(jīng)真空冷凍干燥后即得蕎麥蜂花粉粗多糖[16]。

得率計算:

1.2.3 多糖分離純化

1.2.3.1 Sevag法除粗多糖蛋白 稱取適量蕎麥蜂花粉粗多糖于錐形瓶中,按料液比1∶20 g/mL加入蒸餾水,多糖充分溶解后加入2%的木瓜蛋白酶。在50 ℃下恒溫震蕩水浴酶解1 h,隨后置于90 ℃水浴里滅酶活10 min,5000 r/min下離心10 min,取上清液。采用Sevag法除蛋白[17],重復多次。醇沉后離心取沉淀,冷凍干燥后即得蕎麥蜂花粉多糖,命名為WFPP。

式中:A0為樣品除蛋白前樣品蛋白含量;A1為樣品除蛋白后蛋白含量;B1為樣品除蛋白前樣品中多糖含量;B2為樣品除蛋白后樣品中多糖含量。

1.2.3.2 純化前后多糖基本成分測定 對蕎麥蜂花粉多糖中總糖、可溶性蛋白及糖醛酸含量進行分析測定。采用苯酚-硫酸法[18]測總糖含量,以葡萄糖為標準品,得標準曲線為y=8.6743x+0.0366,R2=0.9997;考馬斯亮藍法[19]測可溶性蛋白含量以牛血清蛋白為標準品,得標準曲線為y=3.225x+0.0299,R2=0.9993;間羥基聯(lián)苯法[20]測糖醛酸含量,以半乳糖醛酸為標準品,得標準曲線為 y=5.006x-0.0054,R2=0.9996。

1.2.3.3 DEAE-52柱層析分離純化 稱取100 mg除蛋白后的多糖樣品溶于10 mL蒸餾水中,充分溶解后經(jīng)DEAE-52纖維素層析,分別用蒸餾水、0.2、0.4 moL/L氯化鈉溶液依次進行梯度洗脫,洗脫流速設置為2 mL/min,每管收集5 min,每個梯度分別收集20管。收集各梯度洗脫液,每管均采用苯酚-硫酸法逐一檢測,以吸光度值為縱坐標,管數(shù)為橫坐標繪制洗脫曲線。合并同一洗脫峰,減壓濃縮后透析除去鹽離子、色素等小分子物質(zhì),冷凍干燥即得精制樣品。

1.2.4 WFPP蕎麥蜂花粉多糖各級分結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.4.1 多糖分子量測定 采用HPLC-RID法[21]測定蜂花粉多糖分子量:精確稱取4 mg多糖樣品溶于超純水中,配制為2 mg/mL的多糖溶液。色譜條件:Agilent HPLC 1260,RID檢測器,TSK gel G5000 PWXL(7.8 mm×300 mm),進樣量為10 μL,流動相為超純水,流速設置為0.5 mL/min,柱溫為30 ℃。用上述方法測定葡聚糖系列(Mw分別為4.32×103、1.26×104、7.38×104、4.96×105、9.90×105、3.75×106Da)保留時間,以標準品相對分子質(zhì)量對數(shù)值lgMw為縱坐標,保留時間t為橫坐標,繪制標準曲線。通過標準曲線計算多糖樣品的分子量。

1.2.4.2 單糖組成測定 采用文獻[22]方法并作適量改進測定蕎麥蜂花粉多糖的單糖組成。

多糖水解:稱取5 mg蜂花粉多糖樣品于安瓿瓶中,加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶解后,充入氮氣封管,置于110 ℃烘箱中水解反應 4 h,取上清液,加入少量甲醇,氮氣吹干,重復多次使三氟乙酸完全除去。

糖腈乙酸酯衍生處理:蜂花粉多糖水解樣品中加入10 mg鹽酸羥胺,0.5 mL吡啶。在90 ℃水浴搖床中震蕩30 min后再加入0.5 mL乙酸酐,90 ℃水浴30 min,反應產(chǎn)物即為糖腈乙酸酯衍生物。過0.22 μm有機濾膜,上氣相色譜進行分析。

GC條件:Agilent HP-5毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),FID檢測器,檢測器溫度及進樣口溫度分別為250、280 ℃,柱溫220 ℃;進樣量1 μL、分流比為20∶1、流速為1 mL/min,載氣為氮氣。程序升溫:初始溫度為160 ℃、保持2 min,20 ℃/min升溫至200 ℃,保持3 min。

1.2.4.3 紫外光譜(UV)分析 將各蕎麥蜂花粉多糖組分配置為1 mg/mL的溶液,在180～400 nm范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描,得掃描曲線。

1.2.4.4 紅外光譜(IR)分析 稱取2 mg多糖樣品,加入適量干燥的KBr研磨制成均勻透明壓片,在4000～400 cm-1范圍內(nèi)用傅里葉紅外光譜儀掃描分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件整理,SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,每個試驗處理設置三個平行,結(jié)果以均值±標準差表示,進行單因素方差分析,不同試驗處理間的顯著性檢驗采用Duncan式多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂花粉掃描電鏡分析

蕎麥蜂花粉呈扁圓形團粒,其細胞壁具有高阻抗性,一般酸堿等物質(zhì)較難破壞?；ǚ酆械臓I養(yǎng)物質(zhì)一般都包覆在花粉壁中,提取其營養(yǎng)成分時花粉壁會阻止其釋放,影響提取效率[23]。所以對蜂花粉多糖的提取,需先破壞其細胞壁,使其內(nèi)容物充分釋放,有利于多糖的提取。

因此,采用超微粉碎技術(shù)對蜂花粉進行破壁,破壁效果如圖1所示。圖1a是未經(jīng)處理的蜂花粉電鏡圖,蜂花粉為完整的細胞群且形體較大胞壁類橢圓形,單個花粉形狀多為長球形,具有多條萌發(fā)孔,表面有較為密集的粗網(wǎng)狀紋理,網(wǎng)眼隨機排布呈不規(guī)則狀[24]。圖1b是經(jīng)過超微粉碎處理后的蜂花粉,花粉細胞形態(tài)基本被全部破壞,花粉團呈無規(guī)則狀,可看出花粉外壁較薄,花粉壁完全裂開并被分解為數(shù)塊碎片,胞內(nèi)物質(zhì)幾乎全部溢出,表明超微粉碎能充分破壞蜂花粉細胞壁,利于下一步蜂花粉多糖的提取。

圖1 未破壁與破壁蜂花粉掃描電鏡圖Fig.1 SEM graphs of bee pollen before and after wall-broken

2.2 蕎麥蜂花粉多糖分離純化

2.2.1 蕎麥蜂花粉多糖的基本組分 蕎麥蜂花粉經(jīng)過水提醇沉、冷凍干燥后得到蕎麥蜂花粉粗多糖,提取率為8.26%。脫蛋白前后蜂花粉多糖中總糖、蛋白質(zhì)及糖醛酸含量見表1,除蛋白前蕎麥蜂花粉多糖總糖含量為46.12%、糖醛酸含量為7.40%、可溶性蛋白含量為8.09%。除蛋白后多糖中總糖、糖醛酸含量顯著升高,可溶性蛋白含量顯著降低。多糖損失率及蛋白清除率分別為26.46%、90.77%,蛋白脫除率較高的同時多糖損失量較少,除蛋白效果較好。碘-碘化鉀反應溶液不變藍,說明多糖不含有淀粉。

表1 脫蛋白前后多糖中總糖、糖醛酸及蛋白質(zhì)含量(%)Table 1 Total sugar,glucuronic acid and protein content in polysaccharide before and after deproteinization(%)

2.2.2 DEAE陰離子交換柱層析 WFPP經(jīng)DEAE-52陰離子柱層析純化,苯酚-硫酸法跟蹤檢測,根據(jù)吸光度和洗脫管數(shù)繪制洗脫曲線,結(jié)果如圖2所示,蕎麥蜂花粉多糖WFPP柱層析分離主要得到三個洗脫峰,分別命名為WFPP-N、WFPP-1、WFPP-2。由圖2可知,采用蒸餾水、0.2 mol/L氯化鈉洗脫液得到洗脫峰較大,三個洗脫峰對稱性都較好。

圖2 WFPP DEAE-纖維素柱層析上洗脫曲線Fig.2 Chromatogram of WFPP on WFPP-cellulose column

收集三個洗脫峰,經(jīng)透析、濃縮、凍干后三個多糖組分的得率及糖含量如表2所示,其中中性多糖組分WFPP-N為灰白色組分,得率為12.73%,總糖含量最高達94.87%,純度較高。酸性多糖組分WFPP-1的得率最高為23.58%,而WFPP-2得率僅為10.41%,總糖含量較低而糖醛酸含量較高,這兩種酸性多糖組分凍干后均為淡黃色粉末。

表2 多糖的得率及糖含量Table 2 The yield and sugar content of polysaccharides

2.3 多糖的結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1 分子量測定 以葡聚糖系列標準品lgMw為縱坐標,葡聚糖標品HPLC圖譜如圖3,不同分子量的葡聚糖標準品保留時間(min)為橫坐標繪制標準曲線,如圖4,得標準曲線為lgMw=-0.3787x+11.77,R2=0.9969。

圖3 葡聚糖標品分子量測定HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of criterion ofglucose for weight determination注:A～F依次表示葡聚糖分子量4320、12600、73800、496000、990000、3750000 Da。

圖4 葡聚糖標準曲線Fig.4 The standard curve of glucan

圖5為三種蕎麥蜂花粉多糖組分的高效液相色譜圖,由圖5可知,WFPP-N、WFPP-1 為單一的洗脫峰且對稱較好,純度較高,分子量分布較為均一,保留時間分別為 19.743、20.417 min,帶入回歸方程,可得到WFPP-N、WFPP-1分子量分別為1.96×104、2.24×104Da。WFPP-2則出現(xiàn)兩個峰形,含有兩個多糖組分,保留時間為 19.514和21.431 min,分子量計算為2.40×104、4.38×103Da。

圖5 多糖的分子量測定HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatograms ofpolysaccharides for weight determination

2.3.2 單糖組成測定 采用氣相色譜法對WFPP-N、WFPP-1及WFPP-2單糖組成進行分析,各單糖標準品和樣品單糖組成色譜圖的出峰順序及保留時間見圖6和圖7,采用與標準單糖色譜圖保留時間對照的方法分析蕎麥蜂花粉多糖的單糖組成。

圖6 混合標準單糖的氣相色譜圖Fig.6 GC chromatogram of mixed standard monosaccharides

圖7 WFPP各級分的氣相色譜圖Fig.7 GC chromatogram of WFPP polysaccharide components

由表3可知,蕎麥蜂花粉中性多糖WFPP-N 則主要由葡萄糖、半乳糖組成,其中葡萄糖含量高達80.70%,其次還含有一定量的半乳糖、阿拉伯糖及少量的木糖,其各單糖物質(zhì)的量比為Rha∶Ara∶Xyl∶Man∶Glc∶Gal=1.15∶2.95∶0.93∶2.53∶80.7∶8.18。蕎麥蜂花粉酸性多糖WFPP-1主要由阿拉伯糖(45.30%)、半乳糖(36.80%)組成,其葡萄糖含量明顯低于中性多糖WFPP-N,僅為3.20%,各單糖組成為Rha∶Ara∶Xyl∶Man∶Glc∶Gal=2.73∶45.30∶1.74∶0.70∶3.20∶36.80。WFPP-2則主要由阿拉伯糖(70.12%),半乳糖(11.27%),鼠李糖(8.19%)組成,并含有少量的木糖、甘露糖,各單糖組成百分含量比為Rha∶Ara∶Xyl∶Man∶Glc∶Gal=8.19∶70.12∶1.72∶1.02∶4.17∶11.27。

表3 單糖組成及含量Table 3 Monosaccharide composition and content of polysaccharide

有研究者[25]發(fā)現(xiàn)分離得到的三種蕎麥蜂花粉多糖中同樣含有Rha、Ara、Xyl、Man Glc、Gal,因檢測方法不同還檢測到含有糖醛酸GalA、GlcA,但均不含有Xyl。同時發(fā)現(xiàn)五味子和油菜蜂花粉多糖其單糖組成也為Rha、Ara、Xyl、Man、Glc、Gal,其百分含量比與本研究有所不同。造成上述多糖的單糖組成種類及比例不同的原因可能與花粉種類、來源、采收產(chǎn)地及采收季節(jié)不同等因素有關(guān)[26]。

2.3.3 紫外光譜掃描 圖8表示蕎麥蜂花粉多糖的紫外光譜圖,未經(jīng)純化的粗多糖在260～280 nm處有較強吸收峰,說明其含有較多蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)。粗多糖經(jīng)過除蛋白,柱層析后主要得到的三種組分WFPP-N、WFPP-1、WFPP-2,在260～280 nm處無明顯吸收峰,表明多糖中基本不含有蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)[27]。

圖8 多糖的紫外光譜圖Fig.8 UV spectrum of polysaccharides

2.3.4 紅外光譜掃描 三種蕎麥蜂花粉多糖組分WFPP-N、WFPP-1、WFPP-2的紅外光譜如圖9所示。三種多糖組分均具有明顯的多糖特征吸收峰。3500～3000 cm-1(3416、3420、3418 cm-1)的吸收峰是由O-H的伸縮振動引起的,峰形較寬而大,表明存在分子間和分子內(nèi)氫鍵[28];3000～2800 cm-1的吸收峰(2930、2929 cm-1)是C-H的伸縮振動,1380 cm-1左右的吸收峰(1383、1384、1382 cm-1)則為C-H的變角振[29];1630 cm-1左右(1626、1621、1603 cm-1)的一組吸收峰是由C=O的伸縮振動引起了的,表明三種多糖組分中都存在羧基基團[30];1020～1100 cm-1出現(xiàn)吸收峰(1153、1077、1081 cm-1)是C-O的伸縮振動峰,說明多糖中含有吡喃糖環(huán)。三種多糖組分在900 cm-1左右處(876、896、881 cm-1)均出現(xiàn)小峰,推測是由次甲基的橫向振動引起的,說明其中含有β-型糖苷鍵[31];經(jīng)分析對比,600 cm-1處附近(723、607、579 cm-1)出現(xiàn)的吸收峰為鼠李糖的特征吸收峰[32],說明三種多糖中都含有鼠李糖。

圖9 多糖的紅外光譜圖Fig.9 IR spectra of polysaccharides

3 結(jié)論

本研究通過水提醇沉法從蕎麥蜂花粉中提取粗多糖,經(jīng)分離純化得到三個多糖組分即WFPP-N、WFPP-1和WFPP-2,通過紫外光譜分析發(fā)現(xiàn)三個多糖組分均不含有蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)。三種多糖均主要由Rha、Ara、Xyl、Glc、Gal、Man六種單糖組成,中性多糖WFPP-N主要由Glc、Gal組成,酸性多糖WFPP-1、WFPP-2則主要Ara、Gal組成,WFPP-2中還含有較多的Rha。WFPP-N、WFPP-1分子量均一,分別為1.96×104、2.24×104Da,WFPP-2中含有兩種分子量的多糖,分別為2.40×104、4.38×103Da,李珊珊[25]對分離得到三種蕎麥蜂花粉多糖組分進行分析鑒定,發(fā)現(xiàn)WFPP-N主要由Glc、Gal及Ara組成,WFPP-1則主要由Ara、Gal構(gòu)成,WFPP-2的主要單糖為Ara、Gal、Rha。除此之外還檢測到三種多糖還含有少量的糖醛酸,但均不含有Xyl。叢大利[15]對三種多糖組分的分子量進行測定,發(fā)現(xiàn)WFPP-N分子量大約集中在2.0×104Da且狀態(tài)不均一。WFPP-1主要含有兩種分子量多糖9.4×105,4.4×104Da。WFPP-2分子量則主要分布于5.7×105、1.6×104Da,分子量大于本研究WFPP-2測定的兩種多糖的分子量。紅外光譜分析三種多糖組分均具有多糖特征吸收峰,且含有β-型糖苷鍵。錢明輝等[33]同樣對蕎麥蜂花粉進行分離純化得到三個多糖級分,但其僅對組分A結(jié)構(gòu)進行了進一步的分析,發(fā)現(xiàn)多糖A主鏈是β-構(gòu)型。本論文對蕎麥蜂花粉多糖進行提取、純化分離及結(jié)構(gòu)分析鑒定,有利于對多糖活性進一步分析,也對開拓蕎麥蜂花粉多糖的應用前景和對其產(chǎn)品的工業(yè)開發(fā)研究奠定理論基礎(chǔ)。