王 琳,李宇軒,劉國榮,范 維,李賀楠,高曉月,董雨馨,陳淑敏,*

(1.中國肉類食品綜合研究中心,北京食品科學研究院,北京 100068;2.北京工商大學,北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京 100048)

生物被膜是微生物為了適應生存環(huán)境而將自身包被于自體產(chǎn)生的黏液性不均一聚合基質(zhì)中,形成一種與浮游細胞不同生長方式的群體[1-2]。形成生物被膜的假單胞菌對環(huán)境耐受性增強,很難從食品接觸面和加工設備表面清除,對食品的貯藏和加工帶來一定危害3[-4]。冷卻肉中腐敗菌種類繁多,其中假單胞菌是優(yōu)勢腐敗菌,能夠分泌大量胞外多糖形成生物被膜粘附在冷卻肉及加工設備表面,且常以生物被膜形式存在[5-6]。

將植物性成分用于控制生物被膜是近年來的研究熱點。徐子恒等[7]用白果外種皮多糖GBSP控制金黃色葡萄球菌生物被膜。張洺嘉等[8]通過測定icaA和cidA兩個被膜相關基因的表達量證明了黃芩素可以抑制金黃色葡萄球SA26112生物被膜的形成。王金玉等[9]通過測定毒力基因的表達量證明穿心蓮內(nèi)酯在亞抑菌濃度下干預生物被膜的形成。大量研究均證明植物活性成分能夠抑制生物被膜,但針對腐敗菌生物被膜的研究不足。

金銀花和蒲公英是原衛(wèi)生部批準的具有抑菌性的藥食同源食品原料,但對肉源性假單胞菌生物被膜的作用效果及機制尚不明確。鑒于此,分析來源于冷卻肉中假單胞菌生物被膜的形成規(guī)律,研究不同質(zhì)量濃度的金銀花提取物和蒲公英提取物對假單胞菌生物被膜的抑制及清除作用,旨在更好地控制假單胞菌生物被膜的產(chǎn)生,為冷卻肉保鮮提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銅綠假單胞菌CICC 10351 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;惡臭假單胞菌5-3、熒光假單胞菌3-2、銅綠假單胞菌5-1、淺黃假單胞菌8-4等共33株菌株 從市售冷卻肉中分離,本實驗室保存;胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、LB肉湯、BHI肉湯、營養(yǎng)瓊脂 北京陸橋生物有限公司;50%戊二醛溶液、結(jié)晶紫、95%乙醇、甲醇、二甲基亞砜 國藥集團化學試劑有限公司;24孔細胞培養(yǎng)板、96孔細胞培養(yǎng)板 美國Corning;FITC-conA(Fluoresce inisothiocyanate-conjugated concanavalin A) 美國Sigma公司;蒲公英提取物、金銀花提取物、金銀花提取物(含98%綠原酸) 南京澤朗生物科技有限公司。

BPC-150F型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;MULTISKANGO1510型酶標儀美國Thermo公司;MQD-S2R恒溫震蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司;TCSSP5激光共聚焦掃描電鏡 Leica Co. Germany。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化 將凍存的菌種于室溫解凍后劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板,30 ℃下培養(yǎng)24 h,取單菌落經(jīng)兩次12 h活化,用無菌生理鹽水稀釋至OD600為0.5備用。

1.2.2 生物被膜形成規(guī)律研究 測定30 ℃下培養(yǎng)12、24、36、48 h的銅綠假單胞菌CICC 10351生物被膜產(chǎn)量,確定最佳培養(yǎng)時間。將33株假單胞菌在30 ℃按照最佳培養(yǎng)時間,分別利用甲醇、乙醇固定,確定最佳固定方法,并于30和4 ℃下檢測33株假單胞菌在最佳培養(yǎng)時間的生物被膜產(chǎn)量。

1.2.3 結(jié)晶紫染色法定量檢測 33株假單胞菌生物被膜產(chǎn)量參考文獻[10-11]的方法測定生物被膜,具體步驟如下:在96孔PVC板中加入195 μL TSB培養(yǎng)基,每孔加入5 μL制備好的OD600為0.5的假單胞菌懸液,每組6個平行孔,以無菌TSB培養(yǎng)基為空白對照。30 ℃靜置培養(yǎng)一定時間后,棄培養(yǎng)液,用生理鹽水清洗3次去除浮游細菌,按照1.2.2的最佳固定方式固定15 min,每孔加入200 μL 0.1%結(jié)晶紫,染色5 min,用生理鹽水清洗3次,干燥后,加入200 μL 30%乙酸溶液,于655 nm下測定數(shù)值。

1.2.4 植物提取物對假單胞菌生物被膜的影響研究 在惡臭假單胞菌5-3形成生物被膜0 h的96孔板中添加含有質(zhì)量濃度為0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50 g/mL的金銀花提取物、蒲公英提取物的TSB培養(yǎng)基,對照組加入等體積不含提取物的TSB培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)24 h,于655 nm下測定數(shù)值,計算生物被膜抑制率。

參考劉永吉等[12]的方法,將假單胞菌在含有TSB培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)24 h,吸出培養(yǎng)基,用生理鹽水清洗被膜3次。添加含有質(zhì)量濃度為0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50 g/mL的金銀花提取物、蒲公英提取物TSB培養(yǎng)基,對照組加入等體積不含提取物的TSB培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)24 h,測定生物被膜,計算清除率。

1.2.5 金銀花提取物對假單胞菌生物被膜的作用 將惡臭假單胞菌5-3菌液稀釋至OD600為0.5,以0.5%接種于含無菌蓋玻片(15 mm)和1 mL TSB培養(yǎng)基的24孔板中,置于30 ℃培養(yǎng)24 h。用PBS清洗孔板3次,添加含有不同質(zhì)量濃度植物提取物(3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL)TSB培養(yǎng)基,并設置空白對照。將24孔板置于30 ℃培養(yǎng)24 h,將菌液輕輕吸出,用PBS清洗3次,每次3～5 min。加入2.5%戊二醛固定2 h后,再用PBS清洗3次。從玻片邊緣吸干水分,在玻片上滴加50 μg/mL的FITC-conA覆蓋,置于4 ℃避光染色30 min[13]。用PBS沖洗后制作載玻片,用LeicaTCS SP5激光共聚焦掃描電鏡在488 nm激發(fā)波長獲取圖像。

1.2.6 掃描電鏡分析金銀花提取物(含98%綠原酸)對假單胞菌生物被膜的作用 采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察植物提取物對生物被膜結(jié)構的作用。將惡臭假單胞菌5-3菌液稀釋至OD600為0.5,以0.5%接種于含無菌蓋玻片(15 mm)和1 mL TSB培養(yǎng)基的24孔板中,置于30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。用PBS清洗孔板3次,將不同質(zhì)量濃度的金銀花提取物添加到TSB培養(yǎng)基中,并設置空白對照。將24孔板置于30 ℃培養(yǎng)24 h,將菌液吸出,用PBS清洗3次,每次3～5 min。加入2.5%戊二醛4 ℃固定過夜,再次用PBS清洗3次。依次用50%、70%、80%、90%、95%乙醇脫水各10 min,100%乙醇脫水3次,每次10 min。將制好的樣品送中科百測公司檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組樣品設有3個重復。采用Microsoft Excel和Origin 7.5進行數(shù)據(jù)處理和作圖。采用SPSS Statistic 18.0(SPSS,USA)對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及Ducan’s檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 假單胞菌生物被膜形成規(guī)律研究

96孔微孔板檢測生物被膜數(shù)值的方法簡便,適用性強,但操作較為繁瑣,培養(yǎng)時間、固定方式、培養(yǎng)溫度對微孔板法測定生物被膜數(shù)值影響較大。本研究以銅綠假單胞菌CICC 10351為模式菌,參考鄒志慧等[15]的方法,在30 ℃下研究培養(yǎng)時間對生物被膜產(chǎn)量的影響,確定了培養(yǎng)24 h為生物被膜積累最佳時間,如圖1所示。

圖1 培養(yǎng)時間對銅綠假單胞菌生物被膜形成的影響Fig.1 Effect of incubation time on theformation of Pseudomonas aeruginosa biofilms注:不同小寫字母代表差異顯著,P<0.05。

圖1表明,隨著培養(yǎng)時間的延長,生物被膜測定數(shù)值顯著升高(P<0.05),30 ℃培養(yǎng)24 h,OD655值達到最高;延長培養(yǎng)時間至36 h,生物被膜測定數(shù)值顯著降低(P<0.05)。這表明銅綠假單胞菌生物被膜在24 h左右是成熟期,24 h后銅綠假單胞菌生物被膜進入衰退期。在生物被膜的生長周期內(nèi),其生物被膜測定數(shù)值所體現(xiàn)的粘附能力很大程度上取決于所粘附材料的類型。Malegori等[16]對熒光假單胞菌DSM50106生物被膜的生長規(guī)律研究表明,在培養(yǎng)第48 h以后,鋼材表面和陶瓷表面的生物被膜數(shù)值均出現(xiàn)降低趨勢。這種現(xiàn)象可能是由于接觸壁材表面缺乏營養(yǎng)而導致生物被膜脫離了表面,塑料表面也會出現(xiàn)這種降低趨勢,只是未在其實驗設定的時間范圍內(nèi)。因此,對于生物被膜的研究不能僅依靠測定數(shù)值,還需要結(jié)合電鏡等方法。

2.2 固定方式對假單胞菌生物測定數(shù)值的影響

圖2是甲醇固定、乙醇固定對生物被膜測定數(shù)值,甲醇固定的測定數(shù)值普遍高于乙醇固定的數(shù)值,這說明甲醇的固定效率更高。淺黃假單胞菌8-4的乙醇固定數(shù)值高于甲醇固定數(shù)值,但乙醇固定數(shù)值結(jié)果差異較大,這可能是由于測定操作過程帶來的誤差。腐敗菌的蛋白水解活性在冷卻豬肉腐敗過程中發(fā)揮重要作用。假單胞菌是冷卻肉中常見的產(chǎn)蛋白酶和?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHLs)的腐敗菌,影響冷卻肉貨架期及食用安全性。AHLs是群體感應信號分子,與水解脂肪或蛋白質(zhì)、產(chǎn)生生物膜等導致冷卻肉腐敗相關的生理功能有關[17]。Molin等[18]研究了200個肉樣中的嗜冷假單胞菌,莓實假單胞菌和隆德假單胞菌也是主要的腐敗菌。相關研究也表明,惡臭假單胞菌在貯藏初期較為常見[19-20]。在冷卻肉中分離篩選的假單胞菌中,惡臭假單胞菌數(shù)量最多,其產(chǎn)生物被膜能力普遍較強,是冷卻肉中最常見的假單胞菌。

圖2 固定方式對假單胞菌生物被膜的影響Fig.2 Effect of immobilized materials on biofilm of Pseudomonas strains

2.3 培養(yǎng)溫度對假單胞菌生物被膜的影響

冷卻肉中具有生物被膜形成能力的菌株,在4 ℃的模擬儲藏環(huán)境中均能形成生物被膜。且多數(shù)菌株在30 ℃生物被膜形成能力較4 ℃更強。30 ℃下，惡臭假單胞菌中粘附力強的菌株為5-3、3-7、2-4；淺黃假單胞菌中粘附力強的菌株為8-4、7-6；銅綠假單胞菌中粘附力強的菌株為5-1；熒光假單胞菌中粘附力強的菌株為3-2、10-3。除菌株3-2以外,熒光假單胞菌在4 ℃時生物被膜的產(chǎn)量要高于30 ℃。生物被膜是菌株在特殊狀態(tài)下的自我保護形式,與培養(yǎng)條件和菌株類型均存在相關性[21]。在冷卻肉加工、運輸、儲藏、銷售過程中,溫度一旦升高,會導致菌體形成生物被膜粘附在冷卻肉及加工設備表面,難以去除,影響食用安全性[22-23]。惡臭假單胞菌5-3在30及4 ℃下形成生物被膜能力均較強,因此后續(xù)研究中以惡臭假單胞菌5-3為研究對象,進行植物提取物對假單胞菌生物被膜的控制作用研究。

圖3 培養(yǎng)溫度對假單胞菌生物被膜的影響Fig.3 Effect of incubation temperature on biofilm of Pseudomonas strains

2.4 植物提取物對假單胞菌生物被膜的影響

分別用金銀花提取物(圖4)和蒲公英提取物(圖5)抑制和清除假單胞菌(5-3)生物被膜。金銀花提取物和蒲公英提取物均可清除假單胞菌在培養(yǎng)24 h形成的成熟生物被膜(圖4B和圖5B)。但在生物被膜形成0 h加入植物提取物對生物被膜的作用效果強于24 h加入的效果,這是由于兩種提取物抑制菌株生長,因此也就抑制了生物被膜的產(chǎn)生。在25～50 mg/mL條件下,生物被膜的清除率略高于50%。50 mg/mL質(zhì)量濃度植物提取物的抑制率低于25 mg/mL的抑制率,這可能是由于50 mg/mL植物提取物在微孔板測定體系里是過量添加,培養(yǎng)過程中存在少量析出,導致溶質(zhì)析出于微孔板表面,與結(jié)晶紫結(jié)合,導致測量結(jié)果增大,需后續(xù)結(jié)合電鏡實驗證明這一猜想。在小于25 mg/mL時,清除率呈現(xiàn)明顯降低趨勢。因此,植物提取物對生物被膜具有清除作用,且對于生物被膜的初始粘附效果更強,對于24 h培養(yǎng)的成熟生物被膜清除效果減弱。

圖4 蒲公英提取物對惡臭假單胞菌5-3生物被膜的影響Fig.4 Effect of dandelion root extract on the biofilm of P. putida 5-3注:A:形成生物被膜0 h時加入蒲公英提取物;B:形成生物被膜24 h時加入蒲公英提取物;圖5同。

圖5 金銀花提取物對惡臭假單胞菌5-3生物被膜的影響Fig.5 Effect of honeysuckle extract on the biofilm of P. putida 5-3

2.5 假單胞菌生物被膜的激光共聚焦觀察

FITC標記的ConA可與胞外多糖特異結(jié)合并發(fā)出綠色熒光。FITC-ConA染色生物被膜后,激光共聚焦顯微鏡下的生物被膜抑制效果見圖6。如圖6A和圖6B所示,在高于最小抑菌濃度25 mg/mL條件下,金銀花提取物通過抑制菌體生長而達到清除生物被膜的效果,其胞外多糖和菌體呈散落狀分布。圖6C和圖6D可見熒光信號增強,菌體明顯聚集,生物被膜厚度增加,且周圍布滿孔隙。在圖6D中可見少量褶皺,這表明在6.25 mg/mL下，生物被膜已經(jīng)開始呈立體結(jié)構。圖6E褶皺、溝壑明顯增多,生物被膜立體結(jié)構呈堆狀連結(jié)。圖6F為TSB培養(yǎng)基對照,為多層的成熟生物被膜。金銀花提取物濃度與其對假單胞菌生物被膜的抑制作用成正相關,在高于最小抑菌濃度下,通過初期抑制菌體生長而抑制菌體形成生物被膜,在低于最小抑菌濃度的條件下,通過抑制生物被膜形成立體結(jié)構抑制生物被膜形成。

圖6 激光共聚焦顯微鏡下金銀花提取物抑制假單胞菌的生物被膜結(jié)構圖(40×)Fig.6 Confocal laser scanning microscopy(CLSM)images of Pseudomonas biofilm structures underthe inhibition of honeysuckle extract(40×)注:A:50 mg/mL金銀花提取物;B:25 mg/mL金銀花提取物;C:12.5 mg/mL金銀花提取物;D:6.25 mg/mL金銀花提取物;E:3.125 mg/mL金銀花提取物;F:TSB培養(yǎng)對照組。

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果對生物被膜的清除效果,見圖7。在培養(yǎng)24 h的成熟生物被膜中加入不同濃度金銀花提取物,隨著提取物濃度的逐漸降低,對生物被膜的清除效果逐漸減弱。隨著金銀花提取物濃度降低,生物被膜褶皺明顯增多,生物被膜立體結(jié)構增強。金銀花提取物對生物被膜的清除作用是通過破壞生物被膜的立體結(jié)構來實現(xiàn)的。

圖7 激光共聚焦顯微鏡下金銀花提取物清除假單胞菌的生物被膜結(jié)構圖(40×)Fig.7 Confocal laser scanning microscopy(CLSM)images of Pseudomonas biofilm structuresunder scavenging effect of honeysuckle extract(40×)注:A:50 mg/mL金銀花提取物;B:25 mg/mL金銀花提取物;C:12.5 mg/mL金銀花提取物;D:6.25 mg/mL金銀花提取物;E:3.125 mg/mL金銀花提取物;F:TSB培養(yǎng)對照組。

激光共聚焦顯微鏡可觀察生物被膜的整體發(fā)展和結(jié)構,而SEM可在高倍鏡下觀察生物被膜的微觀結(jié)構。由于金銀花提取物和蒲公英提取物中主要功效性成分是綠原酸,因此以含98%綠原酸的金銀花提取物清除惡臭假單胞菌5-3生物被膜,SEM成像結(jié)果如圖8所示。生物被膜上的孔洞隨提取物濃度的降低越來越少,且變小,圖8F對照組沒有孔洞。金銀花提取物(含98%綠原酸)清除惡臭假單胞菌5-3生物被膜效果明顯。推測金銀花提取物和蒲公英提取物對假單胞菌生物被膜的清除作用是通過綠原酸發(fā)揮作用的。

圖8 掃描電鏡下金銀花提取物(含98%綠原酸)清除假單胞菌生物被膜的結(jié)構圖(5000×)Fig.8 Scanning electron microscopy(SEM)images of Pseudomonas biofilm structuresunder Scavenging effect of honeysuckle extract(5000×)注:A:50 mg/mL金銀花提取物(含98%綠原酸);B:25 mg/mL金銀花提取物(含98%綠原酸);C:12.5 mg/mL金銀花提取物(含98%綠原酸);D:6.25 mg/mL金銀花提取物(含98%綠原酸);E:3.125 mg/mL金銀花提取物(含98%綠原酸);F:TSB培養(yǎng)對照組。

菌體所產(chǎn)胞外多糖是生物被膜的主要成分,維持生物被膜的結(jié)構和功能[24]。綠原酸是由咖啡酸和奎尼酸形成的酯類物質(zhì),分子結(jié)構中存在不穩(wěn)定的多元酚基[25]。綠原酸對生物被膜的作用機制可能是通過溶解生物被膜中的多糖組分或弱化生物被膜內(nèi)不同分子間作用力,使生物被膜出現(xiàn)孔洞,導致粘附能力降低。陳一強[26]也證明,綠原酸可抑制銅綠假單胞菌的多種毒力因子的釋放,并降低其對載體的粘附能力。因此推測,金銀花提取物中,綠原酸含量是衡量其清除生物被膜功效的重要指標。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn),30 ℃培養(yǎng)假單胞菌24 h能形成成熟生物被膜,甲醇固定生物被膜的效果優(yōu)于乙醇。且30 ℃體外培養(yǎng)條件能夠反映4 ℃冷藏條件下假單胞菌生物被膜形成能力。生物被膜測定結(jié)果表明,惡臭假單胞菌5-3的生物被膜形成能力較強。利用蒲公英提取物和金銀花提取物均能夠抑制、并清除其生物被膜。蒲公英提取物和金銀花提取物在0.78～50 mg/mL范圍內(nèi),對惡臭假單胞菌5-3生物被膜的抑制率均高于50%,抑制效果較好。但在25～50 mg/mL范圍內(nèi)清除率僅為50%,且低于12.5 mg/mL時,清除效果微弱。

激光共聚焦掃描電鏡和場發(fā)射掃描電鏡結(jié)果表明,金銀花提取物(含98%綠原酸)在50 mg/mL主要通過殺菌作用清除生物被膜。隨著質(zhì)量濃度逐漸降低,對生物被膜作用生成形成的孔洞變小、且數(shù)量減少。因此,金銀花提取物和蒲公英提取物能夠抑制并清除假單胞菌生物被膜。本研究證明植物提取物對冷卻肉的保鮮具有潛在應用價值,為植物提取物在冷卻肉保鮮中的應用提供數(shù)據(jù)基礎。但目前的研究無法解釋植物提取物功效性成分對于生物被膜的控制機制,后續(xù)應加強植物提取物功效性成分與細菌生物被膜的分子間相互作用基礎研究。