陳富強(qiáng) 朱海峰 肖晨 李文超 顏鑫 劉虹 李英蓮 陳劍鋒 賀韋東 王露楠 李蓬

2019新型冠狀病毒（2019-nCoV，以下簡稱新冠病毒）是一種線性單股正鏈RNA的新型β屬冠狀病毒，是已知可感染人類的第7種冠狀病毒，可引起人類呼吸道感染[1-4]。截至結(jié)稿，新冠病毒在我國乃至全球持續(xù)蔓延，已成為全球重大的公共衛(wèi)生威脅，對人類身體健康和生命安全造成嚴(yán)重威脅[5，6]。在目前缺乏疫苗和特效藥的情況下，新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期

血漿（COVID-19 convalescent plasma）是臨床特異性治療最可及的資源[7]，適用于病情進(jìn)展較快、重型和危重型患者。國家衛(wèi)生健康委2020年2月14日印發(fā)了《關(guān)于開展新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿治療重癥、危重癥患者的函》（國衛(wèi)辦醫(yī)函[2020]128號），并于3月3日聯(lián)合中央軍委后勤保障部衛(wèi)生局下發(fā)《關(guān)于印發(fā)新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿臨床治療方案（試行第二版）的通知》（國衛(wèi)辦醫(yī)函[2020]185號），要求對新冠病毒血漿抗體進(jìn)行檢測，并測定總抗體或IgG抗體滴度。自2020年2月下旬以來，國內(nèi)一些試劑廠家陸續(xù)研發(fā)出2019-nCoV IgM、IgG和總抗抗體免疫檢測試劑盒。本研究使用3個廠家的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑（分別用A、B、C代替）和1個廠家的膠體金免疫層析法（膠體金）試劑（用D代替），對15例新冠康復(fù)期血漿標(biāo)本進(jìn)行2019-nCoV IgM、IgG抗體檢測，比對分析不同試劑的檢測情況。同時檢測亞甲藍(lán)/光化學(xué)法病毒滅活血漿前后IgG抗體滴度變化，分析病毒滅活對抗體滴度的影響。

材料與方法

1 研究對象 2020年2月15日～2020年3月12日，在山東省血液中心無償捐獻(xiàn)血漿的新冠肺炎康復(fù)者15位。男10例，女5例，年齡21～52歲，平均年齡34.27歲，均為COVID-19康復(fù)者。本研究遵守國際協(xié)調(diào)理事會臨床試驗規(guī)范和赫爾辛基宣言，經(jīng)山東省血液中心倫理審查委員會審核通過，并批準(zhǔn)予以豁免患者知情同意（倫理審批件編號：魯血倫審字[2020]3號）。

普通5 mL EDTA-K2抗凝劑2管全血用于酶免、生化、血型和新冠抗體檢測，含惰性分離膠5 mL EDTA-K2抗凝劑(且要求無酶、無熱源) 1管全血用于核酸檢測。采血后4 h內(nèi)1 500×g室溫離心20 min分離出血漿，2～8 ℃保存，24 h內(nèi)完成核酸檢測。亞甲藍(lán)/光化學(xué)法病毒滅活后留取血漿袋小辮標(biāo)本。

2 試劑與儀器

2.1 2019-nCoV核酸檢測試劑：伯杰核酸檢測檢測試劑盒（批號：20200123C），捷諾核酸檢測試劑盒（批號：GZD2RM2020006A）。

2.2 2019-nCoV抗體檢測試劑：IgG試劑盒來自國產(chǎn)3個廠家A、B、C（均采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗原理），IgM試劑盒來自2個廠家A、B（均采用捕獲法酶聯(lián)免疫吸附試驗原理），2019-nCoV IgG、IgM膠體金聯(lián)合檢測試劑盒來自國產(chǎn)廠家D。A、B、C廠家ELISA試劑均未上市，僅用于臨床試驗或科研。D試劑為經(jīng)國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)上市的試劑。

2.3 主要儀器：Hamilton Microlab FAME (瑞士Hamilton公司)；Hamilton Microlab STAR混樣儀(瑞士Hamilton公司)；ROCHE cobas s201核酸檢測系統(tǒng)；Thermo MULTIFUGE X3F臺式離心機(jī)，三洋低溫冰箱MDF-U443；貝克曼AU640全自動生化儀；貝克曼PK7300全自動血型儀。山東淄博中?？滇t(yī)療器具有限公司生產(chǎn)的病毒滅活柜及配套病毒滅活血漿袋。

3 方法

3.1 遵照《血站技術(shù)操作規(guī)程（2019版）》，對COVID-19 CP標(biāo)本采用2種不同廠家的ELISA試劑開展HBsAg、anti-HCV、HIV Ag/Ab、anti-TP檢測，

并采用羅氏s201核酸檢測系統(tǒng)對HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA進(jìn)行單檢。

3.2 2019-nCoV核酸檢測：委托山東省疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行，采用實時熒光定量PCR方法，伯杰、捷諾2種核酸檢測試劑同時檢測，CT值＞38判為陰性，否則判為陽性。2種試劑均為陰性方可判定結(jié)果為陰性。

3.3 2019-nCoV抗體檢測方法：以下過程除A廠家IgG試劑標(biāo)本稀釋20倍需計算在滴度內(nèi)之外，所有樣本稀釋液的稀釋均不算在滴度計算內(nèi)。

3.3.1 ELISA方法 IgG試劑：A廠家需將待測樣本使用生理鹽水進(jìn)行20倍稀釋，每孔加入樣本稀釋液100 μL，加稀釋后的樣本10 μL進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如果為陽性，則滴度＞20，其他梯度稀釋后的標(biāo)本不用再稀釋20倍；B廠家每孔加入樣本稀釋液100 μL，加5 μL待測樣本進(jìn)行檢測；C廠家每孔加入樣本稀釋液100 μL，加10 μL待測樣本進(jìn)行檢測。

IgM試劑：A廠家每孔加入樣本稀釋液100 μL，加待測樣本10 μL進(jìn)行檢測；B廠家需先將待測樣本5 μL加入500 μL樣本稀釋液中混勻后，每孔加100 μL進(jìn)行檢測。

結(jié)果通過LIS系統(tǒng)傳輸?shù)教粕絾W信息系統(tǒng)9.5自動接收判讀，臨界值（CUT OFF）嚴(yán)格按照說明書公式計算。S/CO值＜1時判定為陰性，否則判定為陽性。

3.3.2 膠體金免疫層析法 IgM、IgG聯(lián)合檢測試劑D：在檢測卡上加待測樣本10 μL，然后加80 μL樣本稀釋液，15 min內(nèi)觀察是否有條帶。對照條帶和檢測條帶同時出現(xiàn)才可判為陽性；只出現(xiàn)對照條帶，判為陰性；對照條帶未出現(xiàn)，判為無效。采用手工加樣、人工判讀，拍照記錄原始結(jié)果。

3.4 抗體滴度檢測：采用生理鹽水對標(biāo)本稀釋，先將待測樣本倍比稀釋后（1×、20×、40×、80×、160×、320×），除A試劑外，按照3.3方法分別進(jìn)行檢測。ELISA法檢測結(jié)果為陽性，則判定滴度＞稀釋倍數(shù)，樣本稀釋液的稀釋倍數(shù)不計算在內(nèi)。根據(jù)廠家建議，A試劑要求的待測樣本20倍稀釋計算在滴度內(nèi)。比如，IgG試劑A，樣本預(yù)稀釋20倍，取10 μL，加到100 μL的稀釋液中進(jìn)行檢測，實際上該樣本被稀釋了大約200倍，結(jié)果若呈陽性，為滴度＞20。應(yīng)用Hamilton Microlab STAR混樣儀完成自動稀釋、加樣，Hamilton Microlab FAME進(jìn)行試驗，加樣、試驗程序均嚴(yán)格按照試劑說明書編程[8]。

3.5 使用A試劑對7例血漿標(biāo)本，在亞甲藍(lán)/光化學(xué)法病毒滅活前、后，進(jìn)行IgG抗體滴度檢測。評估病毒滅活對2019-nCoV IgG抗體滴度的影響。

4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0軟件，對陽性率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 新冠康復(fù)者無償獻(xiàn)血常規(guī)檢測及2019-nCoV核酸檢測情況 遵照《血站技術(shù)操作規(guī)程（2019版）》要求及2019-nCoV核酸檢測結(jié)果均合格（見表1）。

采用貝克曼AU6 4 0全自動生化儀、貝克曼PK7300全自動血型儀分別進(jìn)行谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和ABO/Rh血型檢測。15例獻(xiàn)漿者A、B、O、AB 4種血型均有，分別占20%、26.7%、33.3%和20%，均為RhD陽性；ALT值普遍偏高，雖然均＜50 U/L，符合無償獻(xiàn)血標(biāo)準(zhǔn)，但＞30 U/L的占60%，遠(yuǎn)高于正常獻(xiàn)血者，可能是由于新冠病毒累及肝臟或服用藥物等原因，造成新冠患者肝臟損傷，出院后仍未完全恢復(fù)。ALT過高也是阻礙康復(fù)者捐獻(xiàn)血漿的最主要因素，有3例有強(qiáng)烈捐獻(xiàn)意愿的預(yù)約康復(fù)者，因為轉(zhuǎn)氨酶高（＞90 U/L）而無法捐獻(xiàn)。

2 不同試劑IgM、IgG分析靈敏度比較 嚴(yán)格按照試劑說明書操作。結(jié)果顯示不同試劑對15例標(biāo)本的IgM、IgG檢測結(jié)果存在較大差異（見表2），可能與試劑生產(chǎn)工藝、檢驗原理、靈敏度不同有關(guān)。如C廠家IgG試劑在原倍下檢出率較高，樣本稀釋后未檢出，可能與試劑靈敏度低有關(guān)。樣本稀釋對檢測結(jié)果影響較大，如A廠家IgG試劑4例標(biāo)本（8617、9690、9702、9704）檢測結(jié)果為陰性，但該4例標(biāo)本未稀釋前檢測均為陽性（S/CO值分別為3.62、11.78、1.38、4.30），20倍稀釋后檢測為陰性（S/CO值分別為0.05、0.42、0.03、0.07），根據(jù)試劑說明書應(yīng)以20倍稀釋后的結(jié)果作為該標(biāo)本的最終結(jié)果；其他不需稀釋的3種試劑，該4例標(biāo)本IgG檢測結(jié)果均為陽性，同樣與A試劑的靈敏度有關(guān)。膠體金試劑D檢測15例標(biāo)本IgG均為陽性，5例IgM為陽性，其中2例（標(biāo)本9694，9707）弱陽，條帶顏色較淺（見圖1）。

表1 新冠康復(fù)者無償獻(xiàn)血常規(guī)檢測及2019-nCoV核酸檢測情況

表2 不同試劑IgM、IgG分析靈敏度比較

3 病毒滅活前后2019-nCoV IgG抗體滴度變化情況將7例研究對象血漿病毒滅活前后2019-nCoV IgG抗體檢測結(jié)果進(jìn)行比較（見表3）。7例標(biāo)本全部檢出IgG，因ELISA檢測S/CO值僅在較低數(shù)值時與濃度成正比，因此選擇稀釋后仍為陽性且較低S/CO值的數(shù)據(jù)進(jìn)行穩(wěn)定性比較（見圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7例標(biāo)本在亞甲藍(lán)-光化學(xué)法病毒滅活前后，IgG在不同的稀釋倍數(shù)下定性檢測結(jié)果無變化，S/CO值無明顯變化。因此，我們得出結(jié)論，病毒滅活不會對2019-nCoV IgG抗體滴度產(chǎn)生明顯影響。

討 論

圖1 2019-nCoV IgG、IgM膠體金檢測結(jié)果

由于尚無針對冠狀病毒感染的治療藥物，目前對于冠狀病毒的治療方案多以緩解癥狀、預(yù)防繼發(fā)感染、減少并發(fā)癥發(fā)生以及進(jìn)行器官功能支持為主。其他一些治療方法多來自于治療SARS、MERS及流感的經(jīng)驗,恢復(fù)期血漿可能含有對抗病毒的中和抗體，理論上對感染者應(yīng)有一定治療效果[9]。新冠康復(fù)者恢復(fù)期血漿是由康復(fù)者捐獻(xiàn)的含高效價新冠病毒特異性抗體的血漿，經(jīng)過病毒滅活處理，并對抗新冠病毒中和抗體、多重病原微生物檢測后制備而成，用于新冠肺炎危重患者的治療。臨床反映，有患者接受治療12 h～24 h后，實驗室檢測主要炎癥指標(biāo)明顯下降，淋巴細(xì)胞比例上升，血氧飽和度、病毒載量等重點指標(biāo)全面向好，臨床體征和癥狀明顯好轉(zhuǎn)[10]。

病毒感染機(jī)體后，免疫系統(tǒng)對病毒進(jìn)行免疫防御并產(chǎn)生特異性抗體。其中特異性IgM抗體是機(jī)體感染后早期產(chǎn)生的抗體，IgG抗體是再次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體，提示病情進(jìn)入恢復(fù)期或存在既往感染。2019-nCoV IgM從感染的第7天到第9天呈直線上升，隨后逐漸下降，IgG從感染的第7天到第18天呈直線上升狀態(tài)[1]。為提高新冠康復(fù)期血漿治療效果，國家要求對抗體滴度進(jìn)行檢測。本研究發(fā)現(xiàn)，第2例研究對象（9690）為出院1天康復(fù)者，IgM滴度較高，IgG較低，提示仍處于急性感染恢復(fù)期，雖然核酸檢測連續(xù)多次為陰性，但是體內(nèi)IgM抗體仍處于較高水平，抗體IgG處于較低水平。其他研究對象均為出院14天以上，IgG抗體均為陽性，且滴度檢測高低不等，IgM抗體有的已檢測不出，預(yù)示患者逐漸痊愈，并產(chǎn)生了對病毒的免疫力。提示應(yīng)盡量采集出院14天以上的康復(fù)者血漿。

表3 病毒滅活前后2019-nCoV IgG檢測結(jié)果比較（S/CO值）

圖2 滅活前后IgG抗體S/CO值變化

有研究發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV IgM和IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑具有很高的臨床特異度，分別達(dá)到96.2%和92.41%，敏感度分別達(dá)到70.24%和96.10%，可作為新冠病毒篩查和診斷的有效補(bǔ)充[11]。本研究中，膠體金試劑D為國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)上市的試劑，ELISA試劑截至目前均為未上市試劑，僅用于臨床試驗或科研。從原理上看，膠體金免疫層析法靈敏度應(yīng)低于酶聯(lián)免疫吸附法，但是本研究卻發(fā)現(xiàn)，標(biāo)本9693、9694、9700稀釋40倍使用膠體金檢測IgG為陽性，但ELISA試劑B、C檢測為陰性，可能與標(biāo)本所含抗體物質(zhì)及試劑包被片段差異造成，需進(jìn)一步研究。在IgM檢測方面則相反，膠體金試劑D靈敏度明顯低于ELISA試劑A、B。不同ELISA法試劑之間靈敏度也有差異，標(biāo)本稀釋對靈敏度有影響，易造成靈敏度的下降。從表2結(jié)果來看，A與B、C兩種ELISA試劑的滴度結(jié)果差異較大，A試劑滴度大于160的有2個，B、C試劑沒有滴度大于160的結(jié)果?？赡苁怯捎谠噭┲g靈敏度有差異，抗體滴度和試劑靈敏度掛鉤，相同靈敏度下，才能比較抗體滴度，不同靈敏度不能比較滴度。此外也可能和滴度的計算方法有關(guān)系，本研究僅以標(biāo)本提前使用生理鹽水稀釋的倍數(shù)來計算抗體滴度，反應(yīng)體系中樣本稀釋液的稀釋未計算在滴度稀釋內(nèi)，所有結(jié)果均未乘以反應(yīng)體系樣本稀釋液的稀釋倍數(shù)，故IgG抗體滴度普遍較低。

亞甲藍(lán)(methylene blue，MB)是一種臨床用靜脈注射藥，經(jīng)一定波長光激發(fā)后具有滅活血漿中多種病毒的作用[12]。MB/光化學(xué)法滅活SARS-CoV效果已被證實，對血漿中抗體生物學(xué)活性的影響較小[13]。本研究對亞甲藍(lán)/光化學(xué)法病毒滅活前后的血漿標(biāo)本分別進(jìn)行梯度稀釋，檢測結(jié)果表明滅活前后，IgG抗體滴度均無明顯變化。這可能與光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物作用靶位有關(guān)，MB分子主要作用于病毒核酸和脂包膜上，而抗體是一種糖蛋白，不是MB的主要作用位點。因此，可用MB/光化學(xué)法處理2019-nCoV康復(fù)期患者血漿, 以保證臨床輸血的安全性。

本研究采用不同試劑對15例新冠康復(fù)者血漿2019-nCoV IgM、IgG抗體進(jìn)行檢測，旨在對目前國產(chǎn)試劑進(jìn)行初步評價，分析其性能，為其持續(xù)改進(jìn)提供參考。因所使用的試劑均為早期產(chǎn)品，僅供研發(fā)和臨床試驗使用。隨著研發(fā)的深入，有些已進(jìn)行了改進(jìn)，比如A試劑IgG檢測已不需要對標(biāo)本預(yù)稀釋，檢測靈敏度和特異性均有所增加，這些在未來的研究中將繼續(xù)探討。此外，新冠患者恢復(fù)期血漿抗體滴度水平差異較大，表明由于個體感染病毒狀況不同或機(jī)體免疫應(yīng)答存在差異，在用于治療前進(jìn)行抗體滴度的檢測以保證療效是非常必要的。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突