張立波 戴宇東 龐蓉蓉 鮑晶晶 李燕 葉盛 仲昭衍 傅強

為積極開展新冠肺炎疫情防控[1]，探索有效的治療方案，利用新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿開展臨床治療[2,3]，各地血站都已開始進行恢復(fù)期血漿標本的檢測工作，但由于實驗的復(fù)雜性，尤其抗體檢測需要稀釋及效價檢測，往往采用人工的方式進行前處理，不容易實現(xiàn)標準化；且手工操作帶來的生物安全風(fēng)險問題無法避免[4-6]。我們依托于現(xiàn)用的血站實驗室檢測平臺，建立了新型冠狀病毒IgG、IgM抗體及核酸檢測的自動化平臺方案，使樣本倍比稀釋、前處理加樣和核酸提取等步驟由設(shè)備自動化完成，為血站實驗室開展恢復(fù)期血漿標本檢測提供參考。

材料與方法

1 標本 新型冠狀病毒肺炎康復(fù)者恢復(fù)期大于14天獻血漿人員標本6例。

2 儀器與試劑 主要儀器：全自動加樣器(STAR)、全自動酶免分析儀（FAME）、智能高速冷凍離心機（Thermo）、生物安全柜（Thermo）、熒光定量核酸擴增儀（ABI）。

主要試劑：新型冠狀病毒IgM抗體檢測試劑盒（珠海麗珠）、新型冠狀病毒IgG抗體檢測試劑盒（珠海麗珠）、新型冠狀病毒ORF1ab/N/E基因核酸檢測試劑盒（上?？迫A）。

3 方法

3.1 實驗室新冠病毒相關(guān)檢測平臺工作流程見圖1。

圖1 實驗室新冠病毒相關(guān)檢測平臺工作流程圖

3.2 全自動加樣器程序修改：在原有加樣程序基礎(chǔ)上增加新型冠狀病毒IgM、IgG抗體檢測。IgM抗體檢測按照說明書操作，在加樣位放置與樣本數(shù)相同的潔凈試管，加樣器取1 mL稀釋液加入潔凈試管后吸取10 μL血清加入，為避免氣溶膠，采用液面下混勻吸吐800 μL，混勻6次后加樣；IgG抗體檢測按照說明書操作，在微板位放置96孔稀釋板，加樣器先在反應(yīng)板樣本孔加入100 μL稀釋液，再在稀釋板加入正常人陰性血清作為稀釋劑：橫向第1孔加入270 μL，其余6孔各加入100 μL。取樣本血清35 μL，將5 μL加到反應(yīng)板，在稀釋液液面下加樣。其余30 μL加到稀釋板第1孔，液面下吸吐250 μL進行6次混勻，之后取105 μL分配至反應(yīng)板5 μL，剩余100 μL移至稀釋板第2孔進行倍比稀釋，同樣采用液面下吸吐150 μL進行6次混勻。按照第1孔方式取105 μL加樣5 μL，其他各孔以此類推最終形成1∶10至1∶320稀釋倍數(shù)加樣。

3.3 全自動酶免分析儀程序編輯：按照說明書要求進行實驗。

3.4 全自動核酸提取程序的修改：現(xiàn)有檢測的核酸模板提取程序不變，核酸提取完畢后使用增加的新程序?qū)⒛０宸峙渲罶ARS-CoV-2擴增板后加入陽性對照、陰性對照、引物探針及核酸擴增反應(yīng)液，封板后使用新編輯的SARS-CoV-2擴增程序進行擴增。試劑內(nèi)標選用一對管家基因特異性引物，結(jié)合特異性探針，用于檢測過程監(jiān)控，不影響HBV-DNA、HCV-RNA和HIV-RNA提取及擴增反應(yīng)，可檢測新型冠狀病毒ORF1ab基因、N基因和E基因。根據(jù)說明書要求進行結(jié)果判斷。

3.5 LIS系統(tǒng)方法編輯：根據(jù)說明書及結(jié)果在LIS系統(tǒng)編輯各實驗方法，接收各檢測設(shè)備傳輸?shù)男畔⒓敖Y(jié)果進行整合，打印及發(fā)送報告。

3.6 實驗安全防護：工作人員全程按照生物安全二級防護：佩戴N95口罩、護目鏡、乳膠手套、鞋套、工作服外加穿醫(yī)用防護服、醫(yī)用防護帽，如有接觸樣本或相關(guān)載架及時用酒精進行手衛(wèi)生消毒。對實驗過程中所用的稀釋板和試管進行貼封板紙及加膠塞密封處理，接觸到的試管架等用酒精消毒。實驗室結(jié)束加樣設(shè)備關(guān)閉電源后，使用酒精噴壺對設(shè)備表面、棄針位等風(fēng)險區(qū)域進行消毒處理，之后用移動式紫外線消毒車照射30 min。生化儀、血型儀等設(shè)備按相同方式處理；全自動酶免分析儀配套消毒液deconex 61 DR可滅活HIV、HBV等包膜病毒，按照說明書要求使用60℃熱蒸餾水配置稀釋消毒液進行消毒維護。最后對本試驗產(chǎn)生的醫(yī)療垃圾及檢測樣本進行高壓消毒處理，實驗室按要求進行清潔消毒[7,8]。

結(jié) 果

1 新型冠狀病毒IgM抗體檢測結(jié)果 兩次試驗陰性對照與陽性對照結(jié)果與預(yù)期值相一致，同時6例新型冠狀病毒肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿的IgM抗體檢測結(jié)果都為陽性，多數(shù)結(jié)果S/CO值在3之下，為弱陽性，1例結(jié)果S/CO值大于3，陽性值較高，具體結(jié)果見表1、表2。

表1 兩次試驗新型冠狀病毒IgM抗體試劑陰性對照與陽性對照結(jié)果

表2 6例新型冠狀病毒肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿IgM抗體檢測結(jié)果

2 新型冠狀病毒IgG抗體檢測結(jié)果 兩次試驗陰性對照與陽性對照結(jié)果與預(yù)期值相一致，6例新型冠狀病毒肺炎康復(fù)者出院時間都超過14天，最長者達23天，恢復(fù)期血漿的IgG抗體效價絕大多數(shù)大于1∶160，具體結(jié)果見表3、表4。

3 新型冠狀病毒RNA檢測結(jié)果 兩次試驗陰性對照與陽性對照結(jié)果與預(yù)期值相一致，內(nèi)標結(jié)果正常，6例新型冠狀病毒肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿病毒RNA檢測結(jié)果都為陰性，結(jié)果見表5。

表3 兩次試驗新型冠狀病毒IgG抗體試劑陰性對照與陽性對照結(jié)果

表4 6例新型冠狀病毒肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿IgG抗體檢測結(jié)果

表5 兩次試驗新型冠狀病毒核酸試劑檢測結(jié)果

討 論

從表1、表2可以看出從自動化設(shè)備加樣到酶免檢測分析，所建立的平臺新型冠狀病毒IgM抗體試劑各對照結(jié)果符合預(yù)期值，康復(fù)者恢復(fù)期標本IgM抗體可以良好的被檢出。同時可看到新冠肺炎康復(fù)者出院14天后IgM抗體沒有消失，仍為陽性，分析可能原因為IgM抗體在體內(nèi)存在很長時間。5例結(jié)果都是弱陽性，說明康復(fù)者在恢復(fù)期IgM抗體已經(jīng)持續(xù)下降接近消失，1例IgM抗體陽性值較高，可能與該康復(fù)者體內(nèi)病毒感染持續(xù)時間較長有關(guān)。

從表3、表4也可以看出所建立的平臺新型冠狀病毒IgG抗體試劑各對照結(jié)果均符合預(yù)期值，康復(fù)者恢復(fù)期標本IgG抗體可以良好地被檢出，可以自動化進行倍比稀釋來檢測IgG抗體相對效價。6例新冠肺炎康復(fù)者出院14天IgG抗體都已經(jīng)產(chǎn)生，康復(fù)者有了持續(xù)的免疫力，有5例抗體效價都超過1∶320，1例效價不高，大于1∶40小于1∶80。

從表5可以看出，康復(fù)者血液內(nèi)都不存在新冠肺炎病毒核酸，所建立的檢測平臺對新型冠狀病毒的陽性對照3個基因可以良好的檢出。結(jié)合表2、表4，患者都已經(jīng)處于恢復(fù)期，具有一定的免疫力。以上結(jié)果還提示我們, 采用恢復(fù)期血漿療法時, 是否要考慮IgM抗體必須是陰性，或抗體陽性在何種范圍不能用于患者的治療，或進一步延長康復(fù)者出院后的的血漿采集時間，這樣的療效可能更好。下一步我們還將繼續(xù)收集檢測數(shù)據(jù)判斷出院后多長時間抗體檢測值及效價最高，為臨床使用康復(fù)者恢復(fù)期血漿治療提供數(shù)據(jù)參考。

綜上所述，本研究構(gòu)建了一個自動化、標準化的加樣與檢測新型冠狀病毒相關(guān)檢測平臺，可以完成血站實驗室對新型冠狀病毒肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿標本的篩查工作，同時可避免生物安全風(fēng)險，提高檢測效率，尤其為IgG抗體效價檢測提供了便利的條件。利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突