田姣姣,林 洪,劉天紅,隋建新,王 穎,馮瑞雪,李紅艷,曹立民,*

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;2.山東省海洋生物研究院,山東青島 266104)

貝類、蟹類等海產(chǎn)品由于滋味鮮美而深受消費(fèi)者喜愛(ài)。但是由于自身的強(qiáng)蓄積特性,這些海產(chǎn)品中的重金屬容易富集至很高的濃度,從而導(dǎo)致顯著的食用安全風(fēng)險(xiǎn),其中鎘的超標(biāo)問(wèn)題尤為突出[1-3],關(guān)于其賦存形態(tài)及危害評(píng)估,一直是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)[4-8],但受限于分離分析手段等制約,迄今關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題仍未得以明確闡釋[9-13]。三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是典型的養(yǎng)殖海產(chǎn)品之一,同樣面臨鎘等重金屬所引發(fā)的安全危害;與魚(yú)貝類等其它海產(chǎn)品不同的是,其性腺、肝胰腺等(即俗稱的“蟹黃”、“蟹膏”)是最受喜愛(ài)的可食用部位,恰恰又是重金屬富集的主要區(qū)域[9,14],從而顯著增加了鎘形態(tài)及其危害分析的復(fù)雜程度和難度。

充分、完整地提取分離生物體內(nèi)不同形態(tài)的鎘組分,是準(zhǔn)確開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的前提條件。已有研究表明,海洋生物體內(nèi)有相當(dāng)數(shù)量的鎘是與金屬硫蛋白等生物分子相結(jié)合而存在(metallothionine-Cd等),強(qiáng)酸、有機(jī)溶劑、酶的引入,已被證明能導(dǎo)致有機(jī)鎘復(fù)合物的解離而破壞其初始狀態(tài)或存在提取不完全的現(xiàn)象,比如李敏等[15]的研究證明,有機(jī)溶劑對(duì)水產(chǎn)飼料鎘提取率低于1.6%,而高濃度鹽酸(>1%)又會(huì)導(dǎo)致有機(jī)鎘發(fā)生解離,在鹽酸pH=2.5～3.5(濃度0.025%～0.0025%)的條件下,含鎘的水產(chǎn)飼料中鎘的提取率為9.01%～10.56%,但該部分鎘屬于有機(jī)鎘還是無(wú)機(jī)游離態(tài)離子鎘沒(méi)有表明,無(wú)法確定pH=2.5～3.5的鹽酸是否造成了MT-Cd解離,廖琳[4]的研究則證明堿性蛋白酶對(duì)海豚肝臟鎘的提取率只有45%;目前一般采用與生物體生理?xiàng)l件相似的中性Tris-HCl緩沖液進(jìn)行提取,以最大程度保證鎘的形態(tài)不發(fā)生顯著改變[5,9,16],但是對(duì)貝類、魚(yú)類等海產(chǎn)品的研究表明,該種方法存在無(wú)法將鎘提取完全的問(wèn)題,甚至可能高達(dá)60%以上的鎘存在于難溶于Tris-HCl的殘?jiān)衃10-11]。

目前關(guān)于蟹類產(chǎn)品中鎘形態(tài)的分析,僅有趙艷芳等[9]采用HPLC-ICP-MS確定了金屬硫蛋白鎘(MT-Cd)、谷胱甘肽鎘(GSH-Cd)、半胱氨酸鎘(Cys-Cd)等部分含鎘組分的存在,但仍未實(shí)現(xiàn)充分的分離提取、形態(tài)表征及定性定量分析,說(shuō)明有關(guān)海產(chǎn)品鎘形態(tài)的研究技術(shù)仍存在缺陷。本研究擬以三疣梭子蟹可食用部位的鎘為研究對(duì)象,研究分析Tris-HCl、pH=3.5鹽酸、堿性蛋白酶等不同提取體系的逐級(jí)提取效果,從中篩選有效的提取分離方法;在此基礎(chǔ)上,針對(duì)其中主要的鎘組分進(jìn)行分子質(zhì)量及其分布特征的初步分析,以期為下步更加深入準(zhǔn)確地研究闡釋鎘在蟹類中的賦存形態(tài)及食用風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)手段和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三疣梭子蟹 購(gòu)于北方沿海某城市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);1000 μg/mL鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW(E)081581) 國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心;堿性蛋白酶、5×蛋白上樣緩沖液(含巰基還原劑)、彩虹180廣譜蛋白Marker、5 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(BSA)、Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、3.5 kDa透析袋、500 Da透析袋 北京索萊寶科技有限公司;10 kDa超濾離心管 Millipore 公司;0.22、0.45 μm醋酸纖維素濾膜 邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司;實(shí)驗(yàn)用水 為超純水,電阻率18.2 MΩ·cm;實(shí)驗(yàn)玻璃器皿 均用硝酸溶液(1+4)浸泡24 h以上,并用超純水沖洗干凈;Tris-HCl緩沖液 為pH7.4,10 mmol/L,含0.1 mol/L氯化鈉和5 mmol/Lβ-巰基乙醇。

3k15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;H1850離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;SX2-4-10GJ箱式馬弗爐 蘇州江東精密儀器有限公司;EHD-24電熱消解儀 北京東航科儀儀器有限公司;AA-6800原子吸收分光光度計(jì) 島津儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 三疣梭子蟹去掉蟹殼和不可食用部位,取出其肌肉(包括雌蟹的肌肉和雄蟹的肌肉)、雌蟹性腺和雌蟹肝胰腺(二者合稱蟹黃)、蟹膏(包括雄蟹的性腺和肝胰腺)等可食用部位,分別勻漿分裝,然后于-40 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 三疣梭子蟹可食用部位總鎘含量的測(cè)定 參照國(guó)標(biāo)GB 5009.15-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鎘的測(cè)定》中干法灰化法用馬弗爐進(jìn)行灰化,之后采用火焰原子吸收法測(cè)定鎘含量,每個(gè)部位平行3次,同時(shí)做試劑空白。火焰原子吸收法工作參數(shù)為:波長(zhǎng):228.8 nm;狹縫:1.0 nm;燈電流:8 mA;乙炔空氣流量:1.8 mL/min;背景校正D2。

1.2.3 三疣梭子蟹可食用部位鎘的逐級(jí)提取 稱取2～3 g勻漿樣品(肌肉部位3 g,雌蟹性腺、雌蟹肝胰腺、蟹膏分別2 g,精確到0.001 g)于50 mL離心管中,然后加入一定體積(m∶V=1∶5)經(jīng)4 ℃預(yù)冷的Tris-HCl 緩沖液(10 mmol/L、pH7.4),渦旋搖勻后于4 ℃,8000 r/min 下離心30 min,重復(fù)提取3次,合并上清液得Tris-HCl提取液[9,17-18]。各部位殘?jiān)屑尤胍欢w積(m∶V=1∶5)pH=3.5鹽酸,渦旋搖勻后于4 ℃,8000 r/min 下離心30 min,得HCl提取液[15]和雌蟹性腺、雌蟹肝胰腺、蟹膏的殘?jiān)?。繼續(xù)對(duì)肌肉部位鹽酸提取后的殘?jiān)M(jìn)行提取,加超純水(m∶V=1∶5)均質(zhì),NaOH調(diào)pH至10,加入3%肌肉質(zhì)量的堿性蛋白酶,45 ℃水浴酶解30 min,4 ℃,8000 r/min離心10 min,得肌肉酶解提取液和殘?jiān)黐4,19],用HCl調(diào)節(jié)pH<7。將各步提取液和殘?jiān)謩e蒸干,干法灰化,火焰原子吸收法測(cè)鎘,比較逐級(jí)提取不同處理?xiàng)l件下的提取效果。

1.2.4 Tris-HCl提取液中不同分子量鎘組分的分離 將Tris-HCl提取液放入截留分子質(zhì)量為10 kDa的超濾管中,8000 r/min離心10 min,收集殘留液用于分析>10 kDa組分;濾出液(<10 kDa)繼續(xù)放入截留分子質(zhì)量為100～500 Da的透析袋,加入超純水(V樣品∶V超純水=1∶20),置于4 ℃靜止透析48 h(每隔12 h換一次水),收集殘留液用于分析>500 Da組分。另外將Tris-HCl提取液裝入截留分子質(zhì)量為3.5 kDa的透析袋透析48 h(每隔12 h換一次水),分別收集透出液和殘留液,結(jié)合前述結(jié)果用于分析500 Da～3.5 kDa組分及3.5～10 kDa組分。所收集的各部分溶液分別蒸干消化,消化液定容到合適體積,用火焰原子吸收法檢測(cè)鎘含量,計(jì)算<500 Da、500 Da～3.5 kDa、3.5～10 kDa、>10 kDa等不同組分中鎘的含量及占比。

為了考察超濾效果并分析大分子鎘組分與蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)性,收集Tris-HCl提取液和10 kDa超濾殘留液、濾出液,利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度,然后將各提取液及超濾前后的溶液蛋白稀釋至1 mg/mL,按照Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒說(shuō)明書(shū),制備分離膠、夾層膠、濃縮膠等,上樣電泳,電泳結(jié)束后進(jìn)行染色、脫色掃描,操作過(guò)程參照文獻(xiàn)[20]。

1.2.5 可食用部位總鎘含量和逐步提取率的計(jì)算 可食用部位中鎘含量按公式(1)計(jì)算:

式(1)

式(1)中:X為可食用部位中鎘含量(mg/kg),C為消化液定容后鎘濃度(mg/L),V為消化液定容體積(mL),m為稱取可食用部位質(zhì)量(g)。

可食用部位鎘的逐級(jí)提取率及殘?jiān)Ｓ嗦拾垂?2)計(jì)算:

式(2)

式中:Y為可食用部位鎘的逐級(jí)提取率(%)或殘?jiān)Ｓ嗦?%);Mn表示所提取樣品在該步提取液或殘?jiān)械逆k含量(mg),M總表示所提取樣品中的總鎘含量(mg)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理及單因素方差分析,P<0.05表示顯著性差異,P<0.01表示極顯著性差異;采用Origin 8.5繪制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三疣梭子蟹各部位的總鎘含量

由于難以進(jìn)行準(zhǔn)確有效的分離,雄蟹體內(nèi)的肝胰腺和性腺等未作進(jìn)一步區(qū)分,而合并作為傳統(tǒng)消費(fèi)習(xí)俗中的蟹膏進(jìn)行分析測(cè)試。從三疣梭子蟹體內(nèi)主要的可食用部位來(lái)看,總鎘含量為雌蟹肝胰腺(15.662 mg/kg)>蟹膏(13.758 mg/kg)>雌蟹性腺(1.411 mg/kg)>肌肉(0.184 mg/kg)(圖1),這與前人的研究結(jié)果一致[14,21]。肝胰腺在甲殼類動(dòng)物中相當(dāng)于脊椎動(dòng)物的肝臟,一般認(rèn)為是重金屬蓄積和解毒的主要部位[14],這可能是肝胰腺鎘含量高于蟹類的其他可食用部位的主要原因;蟹膏包括雄蟹的肝胰腺和精巢等性腺器官,因此鎘含量?jī)H次于雌蟹肝胰腺,但大于雌蟹性腺和肌肉。

圖1 三疣梭子蟹可食用部位總鎘的分布Fig.1 Distribution of cadmium inedible parts of Portunus trituberculatus

依照我國(guó)及許多亞洲國(guó)家的習(xí)俗,性腺和肝胰腺等均屬于可食部位,并有蟹黃醬等相應(yīng)的加工制品。按照GB 2762-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》規(guī)定,甲殼類生物體內(nèi)鎘含量≤0.5 mg/kg[22],由此來(lái)看單純的肌肉中鎘未超標(biāo),而性腺和肝胰腺均超標(biāo)嚴(yán)重,并導(dǎo)致可食用部位總體的鎘含量達(dá)到2 mg/kg以上。此外Wiech等[21]針對(duì)面包蟹的研究表明,冷凍解凍以及蒸煮等加工流通過(guò)程中,肝胰腺內(nèi)的鎘可以遷移至肌肉并由此導(dǎo)致其含量超標(biāo)。因此,蟹黃和蟹膏等部位的鎘含量及形態(tài)特征,對(duì)于蟹類的安全評(píng)價(jià)具有重要意義。

2.2 逐級(jí)提取對(duì)可食用部位鎘的提取效果

生物體內(nèi)鎘賦存形態(tài)研究中,提取劑多采用中性Tris-HCl緩沖液。本研究的結(jié)果顯示,對(duì)于全部可食用部位整體而言,單一采用中性Tris-HCl能達(dá)到約92%的總鎘提取率,各部位的提取率則在60.95%～93.93%之間(圖2),尤其是性腺和肝胰腺均能達(dá)到90%以上。這表明三疣梭子蟹中鎘的溶解特性與之前報(bào)道的魚(yú)貝類有所不同,之前關(guān)于海產(chǎn)品的相關(guān)研究中,只有貝類中證實(shí)有40%以上的鎘存在于Tris-HCl提取液中[10],而魚(yú)類和蟹類中均未有明確的定量分析,例如Heidi等[11]采用Tris-HCl提取鯉魚(yú)和鰻魚(yú)腎臟中的鎘,測(cè)定出的含重金屬片段之和小于總鎘含量,趙艷芳等[9]采用Tris-HCl提取梭子蟹體內(nèi)的鎘,HPLC-ICP-MS分離檢測(cè)鑒定出一些鎘的形態(tài),但未將生物體內(nèi)的總鎘與提取出的鎘量比較,沒(méi)有說(shuō)明是否提取完全。而本研究發(fā)現(xiàn),蟹黃和蟹膏等鎘富集程度較高的部位,總體上主要以Tris-HCl提取物存在,通過(guò)這一方式既可以較為充分地將絕大多數(shù)鎘組分提取分離出來(lái),同時(shí)可以較為完整地保持其原有形態(tài)。進(jìn)一步采用酸處理和堿性蛋白酶處理,可以將各部位總鎘的提取率進(jìn)一步提高到93%～99%左右(圖2),基本達(dá)到了完全提取的程度[23],但是考慮到其對(duì)于鎘復(fù)合物賦存形態(tài)的潛在破壞,用于下步形態(tài)分析、危害評(píng)估等研究的價(jià)值可能是非常有限的。

圖2 梭子蟹各食用部位中鎘的逐級(jí)提取結(jié)果Fig.2 Illustration of the ratio of sequential extractionfor cadmium in different tissues of Portunus trituberculatus

肌肉部位鎘的Tris-HCl提取率只能達(dá)到60.95%,進(jìn)一步采用鹽酸處理后效果并不明顯,仍有37%左右殘留,繼續(xù)經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶處理后則可以充分溶出(圖2),這也從側(cè)面證明,其賦存形態(tài)與內(nèi)臟和性腺等部位存在明顯差異,有相當(dāng)數(shù)量的鎘并非以簡(jiǎn)單的游離狀態(tài)存在,而是與生物組織緊密結(jié)合或者已經(jīng)成為結(jié)構(gòu)組分,這一點(diǎn)是之前的研究有所忽略的[11]。綜上，考慮到Tris-HCl既可以將三疣梭子蟹可食用部位中絕大多數(shù)的鎘提取出來(lái),且能最大程度不破壞鎘形態(tài),故將該部分提取物優(yōu)先作為后續(xù)研究對(duì)象。

2.3 Tris-HCl提取物中不同分子質(zhì)量鎘組分的分布

由電泳結(jié)果可知(圖3A、3B),梭子蟹各部位Tris-HCl提取液中蛋白組分的分子質(zhì)量均大于24 kDa。依據(jù)超濾管(Amicon-Ultra-15,Millipore)的選擇和使用原則,截留分子質(zhì)量不應(yīng)大于目的蛋白分子質(zhì)量的1/3。結(jié)合市面上現(xiàn)有的超濾管種類,實(shí)驗(yàn)中選擇截留分子質(zhì)量為10 kDa的超濾管,來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白鎘等大分子鎘復(fù)合物與小分子鎘復(fù)合物的初步分離。肌肉、蟹膏、雌肝胰腺等三個(gè)部位的超濾透出液中蛋白濃度均低于0.01 mg/mL(表1),說(shuō)明采用截留分子質(zhì)量10 kDa超濾管基本上可將不同部位Tris-HCl提取液中的蛋白超濾完全;而雌性腺的透出液中仍有少量蛋白質(zhì)殘余。這一結(jié)果也得到了SDS-PAGE電泳的驗(yàn)證,蟹膏、雌蟹肝胰腺、肌肉等三個(gè)部位的透出液(<10 kDa)中均未出現(xiàn)蛋白條帶,而雌蟹性腺的透出液中在75～135 kDa之間出現(xiàn)電泳條帶,猜測(cè)可能是該部位存在較多的大分子蛋白,而且可能不是常見(jiàn)的球形分子,因此有少量未被Millipore超濾管特有的再生纖維素膜(截留率90%以上)有效截留而混入<10 kDa溶液中。

表1 三疣梭子蟹各部位Tris-HCl提取液超濾前后的蛋白含量Table 1 Protein concentrations of Tris-HCl extractsfrom Portunus trituberculatus before and after ultrafiltration

圖3 梭子蟹各部位Tris-HCl提取液SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE of Tris-HClextracts from Portunus trituberculatus注:A,B:Tris-HCl提取液;C:>10 kDa組分;D:<10 kDa組分;A:超低分子量電泳;B、C、D:大分子電泳;1:Marker;2:肌肉;3:雌性腺;4:雌蟹肝胰腺;5:蟹膏。

采用超濾結(jié)合透析的方式對(duì)Tris-HCl提取液中不同分子質(zhì)量鎘復(fù)合物的分離測(cè)定結(jié)果如圖4所示,發(fā)現(xiàn)各部位分子質(zhì)量>10 kDa的鎘復(fù)合物占比最高,分別達(dá)到90.8%、49.25%、67.6%、64.6%,表明鎘進(jìn)入生物體內(nèi)后主要是與一些大分子物質(zhì)結(jié)合,而這可能是大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)等)含有較多的基團(tuán)-SH、-NH4、-COOH等活性基團(tuán)所導(dǎo)致,這些基團(tuán)一般認(rèn)為具有較強(qiáng)的鎘親和能力[24]。但是這些大分子具體是何種物質(zhì),是否全部是蛋白鎘需要進(jìn)一步研究:以往研究較多的金屬硫蛋白鎘分子質(zhì)量一般在6～7 kDa,即使發(fā)生橋連,也在15～20 kDa左右[17],而從本研究結(jié)果來(lái)看,提取液中蛋白分子質(zhì)量主要處于24 kDa以上,因此該類鎘組分應(yīng)較少含有金屬硫蛋白鎘,或更可能是其它大分子蛋白或者多糖、脂類等與鎘形成的復(fù)合物,例如廖艷等[13]也在企鵝珍珠貝的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了可能與糖類、脂溶性大分子結(jié)合的鎘。這一點(diǎn)與之前認(rèn)為的鎘進(jìn)入生物體主要是與金屬硫蛋白結(jié)合[25-28]存在明顯差異的。

圖4 不同分子質(zhì)量鎘復(fù)合物在Tris-HCl提取鎘中的比例Fig.4 Proportion of cadmium complex of different molecular weight in Tris-HCl extracts注:A:肌肉;B:雌性腺;C:雌蟹肝胰腺;D:蟹膏。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)Tris-HCl提取物中<500 Da的鎘組分占比也較大,分別達(dá)到了4.50%、5.51%、25.13%、9.36%。目前已發(fā)現(xiàn)的離子態(tài)鎘(Cd2+)、GSH-Cd、Cys-Cd均屬于<500 Da小分子鎘組分,但其毒性可能存在顯著差異,因此明確毒性較大的離子鎘(Cd2+)占比,確定其它小分子鎘復(fù)合物的毒理學(xué)特征,將是下步研究重點(diǎn)。除此之外,Tris-HCl提取液中分子量介于500 Da～10 kDa之間的鎘組分,在雌性腺部位可達(dá)45.14%,但在其余部位均占比較低,其可能含有MT-Cd,也可能是其它未知鎘復(fù)合物,目前仍難以確定。

3 結(jié)論

本文針對(duì)三疣梭子蟹肌肉、蟹黃和蟹膏等不同可食用部位中的鎘,通過(guò)對(duì)不同提取方法的效果探究,表明Tris-HCl法具備溫和及保留鎘賦存形態(tài)完整性的優(yōu)勢(shì),其溶于Tris-HCl提取液的鎘是梭子蟹可食部位主要的賦存形態(tài),占內(nèi)臟和性腺的90%以上;而肌肉組織含37%鎘需要堿性蛋白酶處理才可釋放,表明肌肉中部分鎘已經(jīng)牢固地與肌肉組織締合在一起,甚至可能已經(jīng)通過(guò)同化作用成為生物結(jié)構(gòu)的組成成分,而這些對(duì)于進(jìn)一步研究探討海產(chǎn)品中鎘的蓄積轉(zhuǎn)化具有較好的提示意義。

基于超濾透析等手段研究Tris-HCl提取物中不同分子量鎘組分的分布特征,發(fā)現(xiàn)49%以上均屬于分子質(zhì)量>10 kDa的鎘復(fù)合物,表明梭子蟹中的鎘可能與金屬硫蛋白以外的其它大分子如蛋白或者多糖、脂類等形成復(fù)合物,在金屬硫蛋白所介導(dǎo)的途徑之外,可能存在其它的蓄積代謝機(jī)制;分子質(zhì)量處于500 Da～10 kDa之間的鎘組分占比相對(duì)較少,而包含高毒性離子態(tài)鎘分子質(zhì)量<500 Da的鎘組分約占4%～25%?？紤]到有機(jī)鎘與無(wú)機(jī)鎘之間的毒性差異,三疣梭子蟹中鎘的實(shí)際危害很可能與之前基于總鎘的評(píng)估結(jié)論有所不同。

重金屬在水產(chǎn)品體內(nèi)的蓄積和分布狀況可能受多種因素影響,如生物遺傳特性、生活的水質(zhì)、養(yǎng)殖條件等,不同個(gè)體之間可能因此存在差異。因此后續(xù)工作仍需要不斷進(jìn)行驗(yàn)證和完善,以更加精準(zhǔn)地解析三疣梭子蟹中鎘的賦存形態(tài)和分布特征。