秦丹陽,尚貞子,錢明雪,李強(qiáng)明,羅建平

(合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,安徽合肥 230009)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)又稱米斛,為蘭科石斛屬多年生草本植物,主產(chǎn)于安徽大別山地區(qū),其藥用、食用歷史悠久,《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其“久服厚腸胃”[1-2]。霍山石斛含有多糖、氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)、類黃酮、石斛酚、生物堿等多種成分,其中多糖是霍山石斛的主要活性成分,具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、保肝護(hù)胃、增強(qiáng)免疫等功效[3-7]。作為食品原料[8],霍山石斛的不同采收期將嚴(yán)重影響原料的品質(zhì),進(jìn)而影響基于霍山石斛活性成分的功能性食品的開發(fā)與生產(chǎn)。丁亞平等[9]曾對(duì)不同生長年限霍山石斛莖的生物量及礦物質(zhì)、游離氨基酸、多糖、生物堿含量進(jìn)行了測定,但關(guān)于霍山石斛營養(yǎng)成分特別是活性成分理化性質(zhì)與生物活性的年變化情況迄今尚不清楚,因而霍山石斛在用于功能性食品原料時(shí)的采收時(shí)間確定缺乏數(shù)據(jù)支撐。

本研究將以霍山石斛多糖為對(duì)象,分析其理化性質(zhì)、免疫調(diào)節(jié)活性及抗食管癌活性的年動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,以期為霍山石斛功能性食品開發(fā)與生產(chǎn)確定霍山石斛原料的適合采收期提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

霍山石斛 自2017年4月至2018年3月,每月中旬采摘1 kg三年生霍山石斛植株,采摘地為霍山縣天下澤雨生物科技發(fā)展有限公司霍山石斛種植基地;SPF級(jí)昆明小鼠(6～8周,20±2 g) 安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(皖)2017-001;人食道癌EC-109細(xì)胞 中國科學(xué)院細(xì)胞庫;葡聚糖標(biāo)品 美國Sigma公司;胎牛血清、青霉素鏈霉素 美國GIBCO公司;RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Thermo Fisher公司;Alamar Blue 試劑盒 上海貝博生物試劑公司;α-淀粉酶 上海阿拉丁試劑有限公司;三氟乙酸 上海醫(yī)藥化學(xué)試劑有限公司;其余試劑 均為分析純,購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DGF30/7-I電熱鼓風(fēng)干燥箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠;V1100可見光分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;CT15RT高速冷凍離心機(jī) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;MDF-U73V超低溫冰箱、MLS-3750高壓滅菌鍋 日本SANYO公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;XSZ-3G普通光學(xué)顯微鏡 重慶光電儀器有限公司;1260 Infinity高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;Nicolet 67傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司;Varioskan Flash全波長酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司;TU-1901紫外可見分光光度計(jì) 北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司;LGJ-18S原位真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 霍山石斛多糖的提取及含量測定 霍山石斛莖于60 ℃下烘干至恒重后粉碎過80目篩,保存?zhèn)溆谩７Q取適量霍山石斛莖粉末,按1∶20 g/mL的料液比加入無水乙醇,室溫下攪拌浸提4 h,抽濾,分離濾渣和濾液。濾渣重復(fù)浸提4次,風(fēng)干后,按1∶40 g/mL的料液比加入蒸餾水,于70 ℃下攪拌提取1 h,用醫(yī)用脫脂紗布過濾,濾渣重復(fù)提取3次,合并濾液。向?yàn)V液中加入α-淀粉酶(30 U/g無水乙醇浸提后的濾渣),60 ℃下水浴攪拌酶解1 h,酶解液經(jīng)60 ℃減壓濃縮后離心(10000×g,15 min),收集上清。上清液用終濃度為80%的乙醇進(jìn)行醇沉,4 ℃下靜置24 h后過濾收集沉淀,沉淀加水復(fù)溶后離心(10000×g,15 min),取上清液再次醇沉,沉淀經(jīng)過濾、復(fù)溶、離心后真空冷凍干燥(-50 ℃,20 Pa,48 h)得霍山石斛多糖[10]。利用苯酚硫酸法[11],根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0804x+0.0015(R2=0.9992)求得不同月份霍山石斛的多糖含量。

1.2.2 霍山石斛多糖理化性質(zhì)測定

1.2.2.1 紅外光譜掃描 稱取2.0 mg左右的霍山石斛多糖經(jīng)充分干燥后,加入少許干燥的KBr粉末混合研磨,壓成薄片,置于傅里葉紅外光譜掃描儀上進(jìn)行4000～500 cm-1范圍內(nèi)的掃描分析。

1.2.2.2 分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜法[12]測定多糖的分子量。測試分析條件為:Agilent 1260 Infinity系統(tǒng),TSK G5000 PWxl(7.8×300 mm)色譜柱;流動(dòng)相:雙蒸水;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:30 ℃;示差折光檢測器檢測,檢測器溫度:30 ℃?；羯绞嗵菢悠窛舛葹? mg/mL,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。多糖的相對(duì)分子質(zhì)量Mw根據(jù)系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(分子量分別為5.0×103、2.5×104、8.0×104、1.5×105、4.2×105、6.7×105Da,濃度1.0 mg/mL)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-0.3122x+10.39(R2=0.9976)求得。

1.2.2.3 特性黏度測定 利用烏氏黏度計(jì)測定并計(jì)算[13]多糖樣品(1 mg/mL)相對(duì)于蒸餾水的特性黏度。

1.2.2.4 乙酰基含量測定 按Hestrin[14]的方法,將強(qiáng)堿條件下游離出來的乙?；c羥胺反應(yīng)生成乙酰肟羥酸,再與Fe3+生成可溶性紅色絡(luò)合物羥肟酸鐵,該紅色絡(luò)合物在550 nm處有一定的吸收,采用分光光度法進(jìn)行測定(標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.629x+0.0003,R2=0.9995)。

1.2.2.5 單糖組成及摩爾比測定 根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015版中對(duì)鐵皮石斛項(xiàng)下的規(guī)定檢測霍山石斛多糖中甘露糖和葡萄糖的摩爾比[15]。糖液(1 mg/mL)用3.0 mol/L的鹽酸溶液于110 ℃下水解1 h,用0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-比唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazalone,PMP)甲醇溶液于70 ℃下衍生化100 min。取上清液注入液相色譜儀進(jìn)行檢測。色譜條件:填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠,流動(dòng)相為乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液(20∶80,V/V);檢測波長為250 nm。

1.2.3 霍山石斛多糖生物活性測定

1.2.3.1 腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性測定 參照Hong等[16]的方法,將6～8周的昆明小鼠處死,取出小腸,解剖出Peyer’s結(jié)并浸于冷的完全培養(yǎng)液(RPMI 1640培養(yǎng)基含1%雙抗和5%胎牛血清)中。輕輕研磨Peyer’s結(jié)并經(jīng)200目紗布過濾得到細(xì)胞懸液,用臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)法調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106cell/mL。向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入180 μL細(xì)胞懸液及20 μL不同月份的霍山石斛多糖溶液(終濃度為50 μg/mL)。將96孔板置于5% CO2、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)結(jié)束后,離心取上清(條件培養(yǎng)基)備用。

小鼠處死后取出脛骨和股骨,用完全培養(yǎng)液吹洗脛骨和股骨至其變?yōu)榘咨?收集洗出的懸液,于4 ℃、210×g條件下離心10 min得骨髓細(xì)胞。采用臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)法調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×105個(gè)/mL,于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL骨髓細(xì)胞懸液及50 μL的完全培養(yǎng)液和50 μL的條件培養(yǎng)基,再將培養(yǎng)板置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。培養(yǎng)結(jié)束前5 h,向每孔中加入20 μL Alamar Blue試劑,繼續(xù)培養(yǎng)至結(jié)束,最后于激發(fā)波長544 nm、發(fā)射波長590 nm條件下測定熒光強(qiáng)度。

1.2.3.2 霍山石斛多糖體外抑制人食道癌細(xì)胞(EC-109)活性 參照呂品[17]的方法,取對(duì)數(shù)生長期的EC-109細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104cell/mL,向96孔板中每孔加入90 μL細(xì)胞懸液,并置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后每孔分別加入10 μL不同月份的霍山石斛多糖(終濃度為150 mg/mL),空白對(duì)照組為培養(yǎng)基,陽性對(duì)照組為5-氟尿嘧啶(5-FU,終濃度為5 μg/mL)。培養(yǎng)24 h后每孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸出上清,每孔加入150 μL二甲基亞砜,混勻后,在492 nm波長下測定OD值,計(jì)算抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以M±SD的形式表示,采用Origin 8.6軟件繪制圖表,利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理,應(yīng)用One-way ANOVA的方法分析比較各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 霍山石斛多糖含量分析

圖1表明霍山石斛干燥莖的多糖含量存在一定的季節(jié)性規(guī)律,在3～5月份逐步升高,5～9月逐漸下降,5月時(shí)為30.38%達(dá)到全年最高,出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是霍山石斛采收于安徽省大別山地區(qū),該地處于北緯30 °10′～32 °30′、東經(jīng)112 °40′～117 °10′,屬北亞熱帶溫暖濕潤季風(fēng)氣候區(qū),其3～5月的溫度、濕度和光照適宜,霍山石斛光合作用旺盛,多糖大量積累;進(jìn)入5月后,溫度升高且迎來雨季,霍山石斛光合作用減弱,多糖含量開始降低[18-20]。

圖1 不同月份霍山石斛干燥莖的多糖含量變化Fig.1 Polysaccharides content in dry stems ofDendrobium huoshanense harvested in different months注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖5～圖6同。

2.2 霍山石斛多糖的理化性質(zhì)分析

2.2.1 紅外光譜特征分析 紅外掃描光譜(圖2)表明,12個(gè)月份的霍山石斛多糖均在3200～3500 cm-1范圍內(nèi)有一個(gè)-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰,在2900 cm-1附近有一個(gè)C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰,在2890 cm-1附近有一個(gè)C-H的變角振動(dòng)吸收峰,在960、1037、1070、1149 cm-1附近具有吡喃環(huán)構(gòu)型的組峰,在842、896 cm-1附近分別顯示了葡萄糖和甘露糖的吸收峰,在1725 cm-1附近有乙?；奈辗錥21-22]。這些吸收峰的存在表明霍山石斛多糖的特征基團(tuán)穩(wěn)定,不隨生長季節(jié)的變化而改變。

圖2 不同月份霍山石斛多糖的傅里葉紅外光譜掃描分析Fig.2 FT-IR for polysaccharides ofDendrobium huoshanense harvested in different months

2.2.2 分子量及黏度分析 HPGPC分析(圖3,表1)表明,霍山石斛多糖在1～4月及10～12月主要由兩個(gè)組分構(gòu)成,組分1的分子量在96.44～537.93 kDa之間,組分2的分子量在27.39～99.68 kDa之間,而在5～9月份(夏季)只存在高分子量的組分1,低分子量的組分2基本消失。由此可以推測霍山石斛莖中存在兩類分子量不同的多糖,一類隨生長周期變化而存在或者被消耗,另一類則始終存在于霍山石斛中[23]。

圖3 不同月份霍山石斛多糖的HPGPC色譜圖Fig.3 HPGPC chromatograms of polysaccharides in Dendrobium huoshanense harvested in different months注:1:高分子量多糖組分;2:低分子量多糖組分。

表1 霍山石斛多糖的理化性質(zhì)年內(nèi)變化Table 1 Annual changes in physicochemical properties of Dendrobium huoshanense polysaccharides

一般認(rèn)為多糖的特征黏度和它的分子量相關(guān)[24-25]。表1顯示不同月份霍山石斛多糖的黏度和多糖兩個(gè)組分及其分子量存在一定的相關(guān)性,在1～4月份當(dāng)霍山石斛多糖兩個(gè)組分同時(shí)存在時(shí),黏度較低;5～9月份時(shí)霍山石斛多糖只含有組分1,其黏度較高,且黏度值變化與組分1分子量的變化趨勢相似。

2.2.3 乙?；糠治?有研究表明,多糖的藥理功效與其乙?；芮邢嚓P(guān)[26-29]。由表1可知,不同月份霍山石斛多糖的乙?；孔兓秶?.20%～5.62%之間,平均含量為5.03%,其中在2～5月及9月至翌年1月呈下降趨勢,5～9月呈上升趨勢,總體趨勢為秋冬季多糖乙酰基含量高于春夏季。

2.2.4 單糖組成分析 霍山石斛多糖主要由甘露糖和葡萄糖構(gòu)成(圖4),其摩爾比在2.83∶1～5.84∶1之間,變化趨勢與乙?；肯嗨?1～4月及8～12月呈下降趨勢,4～8月呈上升趨勢(表1)。

圖4 霍山石斛多糖單糖組成分析Fig.4 Monosaccharide composition analysis ofDendrobium huoshanense polysaccharides注:A:D-甘露糖標(biāo)品、D-葡萄糖標(biāo)品及鹽酸氨基葡萄糖的HPLC圖(1:D-甘露糖,2:PMP,3:鹽酸氨基葡萄糖,4:D-葡萄糖);B:不同月份霍山石斛多糖的HPLC圖。

2.3 霍山石斛多糖的生物活性分析

2.3.1 腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性分析 由圖5可知,霍山石斛多糖可以通過促進(jìn)腸Peyer’s結(jié)中免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子刺激骨髓淋巴細(xì)胞的增殖,表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)活性,且氣溫較低的季節(jié)(秋、冬、春季)多糖促骨髓淋巴細(xì)胞的增殖效果高于氣溫高的夏季。與空白對(duì)照組相比,1～4月及9～12月的霍山石斛多糖免疫調(diào)節(jié)活性顯著,而5～8月的多糖活性基本消失。與多糖理化性質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析可發(fā)現(xiàn),霍山石斛多糖的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性與多糖的低分子量組分是否存在密切相關(guān),當(dāng)?shù)头肿恿拷M分存在時(shí),多糖的活性較為顯著;同時(shí)多糖的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性與乙?；恳灿嘘P(guān),當(dāng)乙?；枯^低時(shí)多糖的活性較低。

圖5 不同月份霍山石斛多糖對(duì)Peyer’s結(jié)細(xì)胞的腸粘膜免疫活性影響Fig.5 Intestinal mucosal immunomodulatoryactivity of polysaccharides isolated fromDendrobium huoshanense harvested in different months

2.3.2 體外抑制人食道癌細(xì)胞(EC 109)活性分析 由圖6可知,不同月份的霍山石斛多糖對(duì)人食道癌細(xì)胞的生長都有一定的抑制作用,在1～4月份霍山石斛多糖的抑制作用相似,5月份時(shí)抑制率下降至全年最低為31.61%,隨后多糖的抑制作用逐步增強(qiáng),9月份抑制率達(dá)到全年最高為39.65%,10～12月多糖的抑制率有所降低,與1～4月份的作用接近。根據(jù)表1的多糖單糖組成摩爾比變化,可發(fā)現(xiàn)6～9月霍山石斛多糖的甘露糖與葡萄糖摩爾比升高時(shí)其對(duì)人食道癌細(xì)胞生長的抑制作用增強(qiáng)?？傮w上看,秋冬季的多糖抑制效果好于春夏季。

圖6 不同月份霍山石斛多糖對(duì)食道癌細(xì)胞的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of polysaccharides isolated fromDendrobium huoshanense harvested indifferent months on EC 109 cell growth

3 結(jié)論

霍山石斛多糖的理化性質(zhì)及生物活性的年動(dòng)態(tài)變化分析表明,霍山石斛多糖主要由甘露糖和葡萄糖組成的兩組分子量不同的多糖組分所構(gòu)成,其中高分子量組分在霍山石斛莖中一直存在,低分子量組分則隨霍山石斛的生長在5～9月份消失,與此同時(shí)多糖的特性黏度及甘露糖與葡萄糖的摩爾比升高,而4～6月份霍山石斛的多糖含量較高時(shí)乙?；枯^低;霍山石斛多糖的不同組分及乙?；亢蛦翁墙M成摩爾比對(duì)其生物活性有顯著的影響,當(dāng)乙?；拷档突虻头肿恿拷M分消失時(shí)多糖的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性較低,當(dāng)甘露糖和葡萄糖的摩爾比上升時(shí)多糖對(duì)食管癌細(xì)胞生長的抑制作用增強(qiáng)。綜合上述霍山石斛多糖理化性質(zhì)變化與生物活性變化的關(guān)系,可以確定用于功能性食品開發(fā)和生產(chǎn)的霍山石斛原料以秋冬季采收為宜。