閆 敏， 秦詩(shī)潔， 王瓊瑤， 沈 甜， 張 芳， 崔永亮， 許 鳳， 袁 滿， 余秀梅*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川省自然資源科學(xué)研究院，四川 成都 610041)

攀枝花鐵礦蘊(yùn)藏量占全國(guó)總量的16%，尾礦鐵含量為15%～23%，主要存在形式為化合態(tài)Fe3+[1]。大量堆積的鐵尾礦不僅占用較多土地資源、污染農(nóng)耕土壤，還破壞礦區(qū)生態(tài)環(huán)境。土壤中過(guò)量的鐵會(huì)導(dǎo)致植株出葉減緩、葉綠素含量下降、植物干重減少，嚴(yán)重影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。因此，如何有效控制鐵尾礦區(qū)土壤鐵污染已成為急需解決的問(wèn)題。植物修復(fù)具有吸附率大、處理效率高、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)[3]，在治理金屬污染土壤中發(fā)揮著不可替代的作用，其目的是從土壤中提取金屬并改善土壤肥力[4]。豆科植物作為金屬污染地的先鋒植物，利用豆科植物-根瘤菌共生體系的固氮作用來(lái)加速污染地氮素積累，進(jìn)而促進(jìn)污染地的營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)和積累，已成為金屬污染土壤修復(fù)的研究熱點(diǎn)[5]。植物根際微生物可通過(guò)增加生物質(zhì)產(chǎn)量和改變植物組織中的金屬積累來(lái)提高植物修復(fù)效率，促進(jìn)植物抗性[6-7]。豆科喬木植物水黃皮主根較長(zhǎng)，側(cè)根較密，對(duì)許多害蟲具有較強(qiáng)耐受性[8]，此外還具有很強(qiáng)的耐逆性、耐鹽堿、耐旱、耐重金屬并可在酸性、沙、石質(zhì)等貧瘠環(huán)境生長(zhǎng)，種子油可作為生物燃油原材料[9]，為礦區(qū)生態(tài)修復(fù)和土地復(fù)墾的理想材料。根瘤菌與豆科植物共生固氮可為豆科植物生長(zhǎng)代謝提供氮營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)生長(zhǎng)，并能提高逆境中豆科植物的抗逆性[10]。王俊娟等[11]以鐵尾礦砂為基質(zhì)種植苜蓿，接種不同根瘤菌不僅能提高苜蓿的株高、鮮重，還能改善鐵尾礦砂基質(zhì)的理化性質(zhì)和土壤結(jié)構(gòu)，使有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷和速效鉀含量顯著提高。此外，部分根瘤菌分泌的有機(jī)酸、氨基酸等可使土壤酸化，提高土壤中鐵的有效性，促進(jìn)植物對(duì)鐵的吸收[12]。在重金屬等逆境環(huán)境下，根瘤菌可通過(guò)金屬離子泵出、積累、絡(luò)合及有毒金屬向毒性較低形式轉(zhuǎn)化的氧化還原等鈍化作用降低重金屬有效性，表現(xiàn)出不同程度的逆境生長(zhǎng)能力[13-14]，此外還可通過(guò)吸附或解吸機(jī)制保護(hù)植物免受鎳和鋅的毒害作用[15]。據(jù)研究報(bào)道，根瘤菌可通過(guò)吸附、胞外沉淀或結(jié)晶來(lái)抵抗Cu的毒性，也可通過(guò)能量介導(dǎo)的輸出系統(tǒng)來(lái)降低Cu的毒性[16]。相關(guān)研究表明，水黃皮-根瘤菌共生體系能適應(yīng)攀枝花釩鈦磁鐵礦區(qū)被金屬污染土壤的環(huán)境，且能鈍化尾礦土壤中的金屬，但土壤中高濃度鐵會(huì)影響共生體系的固氮作用和修復(fù)效率[8]。因此，本研究主要分析攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土壤中水黃皮共生根瘤菌的鐵耐受性，篩選出鐵鈍化能力強(qiáng)的土著根瘤菌用以強(qiáng)化水黃皮-根瘤菌共生體系，為水黃皮-根瘤菌聯(lián)合修復(fù)釩鈦磁鐵尾礦土壤提供優(yōu)勢(shì)菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 利用5點(diǎn)取樣法從攀枝花新九鄉(xiāng)釩鈦磁鐵尾礦庫(kù)采集釩鈦磁鐵尾礦土壤樣品，裝入無(wú)菌聚乙烯塑料袋中帶回實(shí)驗(yàn)室立即開展水黃皮根瘤菌捕獲實(shí)驗(yàn)。水黃皮種子采自海南省文昌縣紅樹林。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①YMA培養(yǎng)基：甘露醇5.0 g，酵母粉1.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，CaCO33.0 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH 7.0；②TY液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖1.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0；③牛肉膏培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10 g，NaCl 5.0 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 立式高壓蒸汽滅菌鍋(LDZF-75L-Ⅲ，上海申安醫(yī)療器械廠)；雙層恒溫?fù)u床(HY150S，武漢匯誠(chéng)生物技術(shù)有限公司)； 分光光度計(jì)(V-1100D，上海美譜達(dá)儀器有限公司)；離心機(jī)(Centrifuge5148R，艾本德中國(guó)有限公司)；火焰光度計(jì)(FP6410，上海精科儀器有限公司)；PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(Bio-Rad公司)；ICP-AES(美國(guó)熱電公司)。

1.2 方法

1.2.1 水黃皮共生根瘤菌的捕獲與分離純化 選取飽滿成熟水黃皮種子播種，置于25 ℃溫室進(jìn)行預(yù)發(fā)芽。取幼苗栽種于裝滿尾礦土的滅菌白色塑料盆中，放置溫室中培養(yǎng)90 d后，挑選出水黃皮根系粒大、紅潤(rùn)的根瘤，將根瘤表面洗凈后，在無(wú)菌工作臺(tái)中用0.1% HgCl2溶液、75%酒精表面消毒后放入EP管中，擠破根瘤，用無(wú)菌玻璃棒沾取汁液接種于YMA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)單菌落，通過(guò)革蘭染色和鏡檢初步篩選出根瘤菌，保存在YMA斜面(4 ℃)上和甘油管(-80 ℃)中。

1.2.2 水黃皮共生根瘤菌對(duì)Fe2+/ Fe3+的耐受性測(cè)定 將分離純化得到的菌株接種于5 mL TY液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)24 h后吸取50 μL新鮮菌液接種于含不同濃度Fe2+/Fe3+的超純水溶液(質(zhì)量濃度梯度為0.2 g/L)，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h后，用不接菌的TY培養(yǎng)液做參比測(cè)定OD600值以確定菌株的存活情況及生長(zhǎng)狀況，(OD600≥0.1視為可生長(zhǎng))。

1.2.3 水黃皮共生優(yōu)勢(shì)根瘤菌分子鑒定 水黃皮共生根瘤菌DNA提取采用GUTC(異硫氰酸胍)法[17]，根瘤菌16S rRNA基因測(cè)序擴(kuò)增引物[8]27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸5 min，終止[18]。對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由深圳華大基因公司進(jìn)行測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST相似性分析，用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，明確根瘤菌在種屬水平上的分類地位。

1.2.4 水黃皮共生根瘤菌對(duì)Fe2+/ Fe3+鈍化效率測(cè)定 將耐受性較好的菌株接種于150 mL TY液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞，無(wú)菌水沖洗2次后分別加至不同質(zhì)量濃度(200、400、800、1 600 mg/L)1.5 mL Fe2+/Fe3+溶液，搖勻后28 ℃、150 r/min培養(yǎng)6 h；將菌液離心后取上清液，用ICP-MS測(cè)定上清液中Fe2+/Fe3+濃度，并計(jì)算Fe2+/Fe3+鈍化效率。計(jì)算公式：

式中，C1、C2分別為Fe2+/Fe3+的起始濃度和鈍化后的濃度(mg/L)，A為菌株在實(shí)驗(yàn)中對(duì)Fe2+/Fe3+的鈍化效率(%)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft office 2016和 SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐Fe2+/Fe3+水黃皮共生根瘤菌篩選

采用平板劃線法從水黃皮共生根瘤中分離純化根瘤菌，在挑選單菌落時(shí)，主要根據(jù)其菌落形態(tài)大小、顏色、形狀等，挑選特征與根瘤菌相似的菌株純化后經(jīng)革蘭染色及鏡檢(呈陰性)，初步篩選出根瘤菌39株。如圖1所示， 39株根瘤菌對(duì)200 mg/L Fe2+和Fe3+均具有抗逆性，所有菌株均能順利存活；隨著Fe2+和Fe3+濃度提高，菌株抗逆性逐漸減弱，存活率整體呈下降趨勢(shì)，在400以及1 000 mg/L Fe2+/Fe3+質(zhì)量濃度下，生長(zhǎng)受到抑制的菌株數(shù)量跳躍式增加，尤其是Fe2+對(duì)根瘤菌的存活情況影響更為顯著，400 mg/L Fe2+質(zhì)量濃度條件下存活菌株減少為25株，1 000 mg/L Fe2+質(zhì)量濃度條件下存活菌株僅剩10株。所有菌株在1 600 mg/L Fe2+/Fe3+質(zhì)量濃度下存活率僅為10%(圖2)，根據(jù)Fe耐受性實(shí)驗(yàn)篩選出不同F(xiàn)e2+/Fe3+濃度下抗逆性較好的菌株P(guān)ZHS20、PZHS87以及PZHS90共3株。

2.2 根瘤菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析

根瘤菌抗逆優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)ZHS90、PZHS87、PZHS20的16S rRNA基因測(cè)序片段大小為1 143 bp，其在GenBank中分別與慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)高度同源，其同源性高達(dá)100%。選取慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)的不同種作為參比菌株，構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，PZHS90、PZHS87、PZHS20分別鑒定為埃爾坎慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)、埃爾坎慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)、人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropic)(圖3)。

圖1 根瘤菌在不同質(zhì)量濃度Fe2+/Fe3+脅迫下的存活情況Fig.1 Survival of Rhizobium strains in the stress of different concentration Fe2+/Fe3+ “1”對(duì)應(yīng)的圖中黑色區(qū)域代表根瘤菌在相應(yīng)Fe2+/Fe3+濃度下能正常生長(zhǎng)，即與相同處理?xiàng)l件下不接菌的TY培養(yǎng)液體相比可明顯觀測(cè)到菌細(xì)胞，判斷為該條件下菌株可以存活；“2”對(duì)應(yīng)的白色區(qū)域則反之 The blake area in theFigure corresponding to "1" represents that the Rhizobium can grow normally under the corresponding Fe2+/Fe3+ concentration, it means the bacterial cells can be clearly observed compared with the TY culture liquid which is not inoculated under the same treatment conditions, and it is judged that the strain can survive under the condition; the white area corresponding to "2" is the opposite

圖2 釩鈦磁鐵礦土中水黃皮共生根瘤菌對(duì)Fe2+/Fe3+耐受性Fig.2 Resistance of Pongamia pinnata symbiotic rhizobia in vanadium titanium magnetite soil to Fe2+/Fe3+

圖3 耐Fe2+/Fe3+水黃皮根瘤菌16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the 16S rRNA gene of Rhizoctonia solani with tolerance to Fe2+/Fe3+

2.3 根瘤菌對(duì)Fe2+/Fe3+耐受性分析

不同F(xiàn)e2+質(zhì)量濃度下，各菌株在0～400 mg/L生長(zhǎng)幾乎未受影響，生長(zhǎng)狀況較好。隨著Fe2+濃度增加，菌株生長(zhǎng)均受到不同程度抑制，但3株菌株均能在1 600 mg/L Fe2+質(zhì)量濃度中生長(zhǎng)，其中以PZHS90耐受能力最強(qiáng)，細(xì)胞濃度約占200 mg/L的17.7%；1 000～1 200 mg/L質(zhì)量濃度下PZHS90抑制作用最為明顯，1 000 mg/L時(shí)PZHS90細(xì)胞濃度約為200 mg/L的62.8%，1 200 mg/L時(shí)菌株P(guān)ZHS90細(xì)胞濃度僅為200 mg/L的27.4%，耐受能力下降幅度較大(圖4)。

圖4 不同F(xiàn)e2+質(zhì)量濃度下根瘤菌生長(zhǎng)曲線Fig.4 Fe2+ Growth curve of rhizobia in different concentration of Fe2+ solution

不同小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)，下圖同

The different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05)， the same below

在0～400 mg/L Fe3+質(zhì)量濃度下，各菌株生長(zhǎng)較為良好，受Fe3+影響較小，低濃度下耐受能力更強(qiáng)。隨Fe3+濃度增加，菌株生長(zhǎng)狀況均出現(xiàn)較明顯變化，其中以400～800 mg/L下耐受能力變化最為明顯；3株菌株均能耐受1 600 mg/L Fe3+，1 800 mg/L時(shí)PZHS90不能生長(zhǎng)，PZHS20、PZHS87均能生長(zhǎng)，其中以PZHS20耐受能力最強(qiáng)，1 800 mg/L Fe3+細(xì)胞濃度約為200 mg/L的9.2%；PZHS20在400 mg/L下細(xì)胞濃度約為200 mg/L的92.1%，800 mg/L下細(xì)胞濃度約為200 mg/L的47.8%，菌株耐受能力降低幅度較大(圖5)。

2.4 根瘤菌對(duì)Fe2+/Fe3+鈍化能力測(cè)定

在不同F(xiàn)e2+濃度下，各菌株的鈍化能力整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中在800～1 600 mg/L Fe2+質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，菌株鈍化能力下降更為明顯。在低質(zhì)量濃度(200 mg/L)時(shí)，各菌株對(duì)Fe2+鈍化效率均在70%以上，以PZHS20鈍化能力較強(qiáng)，較PZHS90、PZHS87分別高出2.1%、5.0%；當(dāng)Fe2+質(zhì)量濃度為400 mg/L時(shí)，3株菌株鈍化能力均在70%左右；當(dāng)Fe2+質(zhì)量濃度為800～1 600 mg/L時(shí)，各菌株鈍化效率顯著性差異不明顯，1 600 mg/L Fe2+環(huán)境下各菌株間鈍化效率均在10%以上(圖6)。

圖5 不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度下根瘤菌生長(zhǎng)曲線Fig.5 Fe3+ Growth curve of rhizobia in different concentration of Fe3+ solution

圖6 不同質(zhì)量濃度下根瘤菌Fe2+鈍化效率測(cè)定結(jié)果Fig.6 Fe2+ Passivation rate of rhizobia in different concentration of Fe2+ solution

在不同F(xiàn)e3+濃度下，各菌株整體鈍化能力隨Fe3+濃度增高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，0～400 mg/L變化不太明顯，800～1 600 mg/L出現(xiàn)明顯下降。當(dāng)Fe3+質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，各菌株對(duì)Fe3+鈍化效率均高于80%，顯著性差異不明顯；當(dāng)Fe3+質(zhì)量濃度為400 mg/L時(shí)，各菌株鈍化效率在80%左右，其中PZHS20較PZHS90、PZHS87分別高出2.3%、3.9%；當(dāng)Fe3+質(zhì)量濃度為800 mg/L時(shí)，以PZHS20鈍化能力較佳，較PZHS90、PZHS87分別高出2.9%、5.5%，顯著性差異明顯；當(dāng)Fe3+質(zhì)量濃度為1 600 mg/L時(shí)，各菌株鈍化效率均高于20%，顯著性差異不明顯(圖7)。

在200、400及800 mg/L Fe2+/Fe3+質(zhì)量濃度下，PZHS20、PZHS90及PZHS87鈍化Fe2+/Fe3+的量隨Fe2+/Fe3+濃度增高不斷增加，當(dāng)Fe2+/Fe3+質(zhì)量濃度達(dá)到1 600 mg/L時(shí)，3株根瘤菌對(duì)Fe2+/Fe3+實(shí)際鈍化量顯著減少，尤其是對(duì)Fe2+的平均鈍化量?jī)H為173.23 mg/L，相比800 mg/L時(shí)減少了303.62 mg/L，表明Fe2+/Fe3+濃度過(guò)高時(shí)，菌株對(duì)鐵的鈍化能力受到明顯抑制。同時(shí)，相同濃度下PZHS20、PZHS90及PZHS87對(duì)于Fe3+的鈍化能力均顯著高于對(duì)Fe2+的鈍化能力(表1)。且隨著Fe2+/Fe3+濃度增加，3株根瘤菌對(duì)Fe2+和Fe3+實(shí)際鈍化量的差異愈發(fā)明顯，當(dāng)Fe2+/Fe3+質(zhì)量濃度達(dá)到1 600 mg/L時(shí)差異最為顯著，這一結(jié)果應(yīng)該與Fe3+具有強(qiáng)氧化性有關(guān)。

圖7 不同質(zhì)量濃度下根瘤菌Fe3+鈍化效率測(cè)定結(jié)果Fig.7 Fe3+ Passivation rate of rhizobia in different concentration of Fe3+ solution

表1 根瘤菌在不同F(xiàn)e2+/Fe3+質(zhì)量濃度條件下鈍化Fe2+/Fe3+的能力

注：同一Fe質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討 論

攀枝花地區(qū)礦業(yè)發(fā)達(dá)，釩鈦磁鐵尾礦堆積較多，尾礦鐵含量約為212.7 g/kg[8]。雖然鐵不屬于重金屬，但其含量過(guò)多同樣會(huì)影響植物正常生長(zhǎng)[19-20]。水黃皮在鐵尾礦土壤中生長(zhǎng)狀況良好，且能與根瘤菌共生結(jié)瘤，說(shuō)明水黃皮能適應(yīng)金屬含量高的尾礦土壤等極端環(huán)境，具有較強(qiáng)的抗逆能力。本研究通過(guò)對(duì)鐵尾礦水黃皮共生根瘤菌的捕獲、分離與純化獲得對(duì)高濃度Fe2+/ Fe3+有抗逆性的根瘤菌39株，說(shuō)明攀枝花釩鈦磁鐵尾礦中有豐富的耐鐵細(xì)菌資源。Carrasco等[21]從黃鐵礦溢出污染區(qū)分離得到41株根瘤菌可耐高達(dá)300 mg/L As、100 mg/L Cu和500 mg/L Pb；Vidal等[22]從法國(guó)南部鋅尾礦篩選出MesorhizobiummetalliduransSTM 2683，可耐受32 mmol/L Zn和0.5 mmol/L Cd。根瘤菌能與豆科植物共生結(jié)瘤固氮，將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為有效氮，補(bǔ)充土壤氮供給，改善土壤營(yíng)養(yǎng)狀況[23-25]。有些根瘤菌還具有溶磷、解鉀等功能，促進(jìn)植株對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收與利用，增加植物的抗逆性[26]，在微生物-植物聯(lián)合修復(fù)尾礦中可發(fā)揮重要作用。

本研究篩選出對(duì)鐵耐受性強(qiáng)的埃爾坎慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)、人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropic)在200 mg/L Fe2+/ Fe3+溶液中對(duì)Fe2+/ Fe3+鈍化效率分別為70%和80%。由此可知，鐵耐受根瘤菌可能具備鐵鈍化功能。微生物富集重金屬主要通過(guò)胞內(nèi)外沉積作用等機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)[27]，而微生物對(duì)鐵鈍化機(jī)理尚不清楚，但可能與重金屬鈍化機(jī)制大致相同[28]。據(jù)研究報(bào)道，不同鐵濃度下菌株鈍化能力還受pH[29]、溫度[30]等因素影響。本研究中耐鐵根瘤菌的鐵鈍化效率隨Fe2+/Fe3+濃度的上升而下降，可能與菌株在不同F(xiàn)e2+/Fe3+濃度下的耐受能力密切相關(guān)，隨Fe2+/Fe3+濃度增加菌株生長(zhǎng)受到不同程度抑制，菌體實(shí)際鈍化Fe2+/Fe3+的量與溶液中Fe2+/Fe3+總量的比值逐漸減小，鈍化效率逐漸降低。本研究從含高濃度鐵的釩鈦磁鐵尾礦土壤中分離篩選出兼具Fe2+/Fe3+耐受性和鈍化能力的根瘤菌資源，為水黃皮-根瘤菌聯(lián)合修復(fù)釩鈦磁鐵礦尾污染土壤提供了可利用的菌株資源。