梅晨雪， 梁愛媛， 高詩雨， 鄭長清*

(1．中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院，遼寧 沈陽 110022；2.福建醫(yī)科大學(xué)，福建 福州 350122；3.中國醫(yī)科大學(xué)，遼寧 沈陽 110122)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是全球第三大常見癌癥，每年新發(fā)病例約為136萬，近70萬例死亡[1]。目前，明確的引發(fā)CRC的危險因素首先是缺乏鍛煉、吸煙、過量食用紅肉和加工肉以及飲酒等不健康的行為。相較于小腸，大腸中細(xì)菌密度最大(大腸細(xì)菌1012個/mL對比小腸104個/mL)，CRC的發(fā)生也可受腸道菌群的影響。在過去的幾十年中，很多研究發(fā)現(xiàn)了腸道菌群對CRC發(fā)展的作用機制，對腸道菌群進行深入研究成為預(yù)防和治療CRC的一個重要途徑。由于菌群組分在個體之間差異極大且高度依賴于生活方式、飲食和個體基因型，所以對脂質(zhì)代謝、維持腸道穩(wěn)態(tài)或者致癌作用的機制也不盡相同。結(jié)直腸中有10 萬億～100萬億個共生菌參與代謝食物、消化分泌物以及脫落的結(jié)腸細(xì)胞，菌群在人體內(nèi)發(fā)揮著巨大的作用，對人類健康產(chǎn)生深遠的影響。菌群與自生或與其他菌群甚至與周圍微環(huán)境中的物質(zhì)進行著復(fù)雜的相互作用。此文將重點介紹腸道菌群的重要作用，尤其是菌群與腸道穩(wěn)態(tài)及誘發(fā)癌癥的重要作用。

1 腸道菌群與腸道穩(wěn)態(tài)

1.1 物質(zhì)代謝

據(jù)統(tǒng)計，超過1 000種細(xì)菌共生在人體腸道中。盡管這些菌群在腸道中具有一定穩(wěn)定性，但它們之間的比例會隨著時間的推移和個體之間的差異發(fā)生很大變化。在單個個體中，菌群的數(shù)量和組成也存在空間變異性，研究發(fā)現(xiàn)，胃和十二指腸內(nèi)容物中細(xì)菌約有10～103個/g，小腸約為104～107個/g，大腸內(nèi)容物中的細(xì)菌接近1011～1012個/g[2]。腸道菌群在人體代謝中為宿主提供重要的代謝物，如促使膳食碳水化合物中的簡單糖類轉(zhuǎn)化為有機酸如短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)，并使其發(fā)酵產(chǎn)生氣體?？僧a(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌，能將有機酸轉(zhuǎn)化為對宿主有益的SCFAs，為結(jié)腸細(xì)胞提供能量[3]，增強腸屏障功能和減少氧化應(yīng)激反應(yīng)等[4]。腸道內(nèi)的脂質(zhì)可以來自腸本身，也可來自脫落的上皮細(xì)胞甚至來自細(xì)菌[5]。內(nèi)源性膽固醇及其他脂類代謝的膽汁酸中僅有5%到達結(jié)腸，被細(xì)菌代謝成二級膽汁酸，腸源性敗血癥就是擬桿菌將初級膽汁酸解離和脫水轉(zhuǎn)化為結(jié)腸中的二級膽汁酸(脫氧膽酸和石膽酸)形成的具有致癌作用的病理反應(yīng)，許多細(xì)菌具有蛋白酶活性，可以將蛋白質(zhì)水解成小肽繼而被菌群代謝為氨基酸，從而成為其他細(xì)菌的能量來源或氮源[6]。

1.2 腸黏膜屏障維持

腸上皮的主要功能是形成屏障，保護腸道免受外部環(huán)境的影響，以調(diào)節(jié)來自內(nèi)腔的營養(yǎng)物、電解質(zhì)和水分，并維持菌群環(huán)境與宿主之間的穩(wěn)態(tài)。腸黏膜和上皮細(xì)胞的緊密連接共同形成腸上皮的保護功能，有報道提示腸黏膜會在無菌小鼠腸道中發(fā)育不良，從而對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎具有高度易感性[7]。此外，通過腸道菌群產(chǎn)生的SCFAs可以通過上調(diào)緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的表達來降低通透性，從而起到腸屏障的保護作用[8]。無菌動物由于緊密連接蛋白和黏液蛋白的低表達，易發(fā)生腸屏障受損。因此菌群在保護腸道完整性方面起到重要作用。

1.3 腸道免疫調(diào)節(jié)

腸道菌群通過先天性免疫成分對黏膜及全身免疫系統(tǒng)起調(diào)控作用。固有免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞活化后具備吞噬侵入性細(xì)菌的能力，并產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子IL-10維持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)[9]。中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞可通過分泌IL-22以及利用免疫球蛋白-A(IgA)激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在先天免疫中發(fā)揮作用。樹突細(xì)胞(Dendritic Cells，DCs)或上皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子可使先天性淋巴樣細(xì)胞激活，其中表達核孤兒受體γ的3型先天淋巴細(xì)胞(Type 3 Innate Lymphoid Cells，ILC3)被IL-1、IL-6和IL-23激活，使其聯(lián)合共生菌產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17/IL22[10]。ILC3還具有誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生黏液和抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)的能力。此外，ILC3通過產(chǎn)生粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子直接影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生[11]。細(xì)菌定殖誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞17(T helper 17，Th17)產(chǎn)生能夠控制腸道細(xì)菌的IL-17，IL-17通過刺激上皮細(xì)胞產(chǎn)生的AMPs可募集中性粒細(xì)胞以及促進IgA的分泌[12]。腸道內(nèi)的免疫反應(yīng)隨細(xì)菌密度而變化，并且取決于菌群類型。調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中最重要的細(xì)菌是與梭菌相關(guān)的分段絲狀細(xì)菌(segmented filamentous bacteria，SFB)，主要黏附于上皮表面和Peyer′s斑塊以獲取營養(yǎng)[13]。腸道菌群除在腸道免疫系統(tǒng)中的作用外，還對菌群外周環(huán)境有間接影響。雖然這些機制尚不明確，但已有證據(jù)表明腸道菌群可通過細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物中可溶性因子的擴散產(chǎn)生外周效應(yīng)[14]。

1.4 病原體防護

腸道菌群在防止病原體定殖腸道方面起著至關(guān)重要的作用，共生微生物群和細(xì)菌病原體在腸道定殖的微環(huán)境一致。共生細(xì)菌能夠產(chǎn)生特異性抑制同種細(xì)菌的菌素和毒素，其中由人和不同動物分離出幾種共生大腸埃希菌(Escherichiacoli)菌株所產(chǎn)生的細(xì)菌素可抑制致病性腸出血性E.coli的生長[15]。同樣，一些共生菌產(chǎn)生的SCFAs可以通過改變pH值對某些病原體如沙門氏菌產(chǎn)生毒性作用[3]，SCFAs尤其是丁酸鹽，已被證明可通過下調(diào)沙門氏菌致病島1基因的表達來抑制沙門氏菌的毒性，從而限制該病原體對上皮細(xì)胞的侵襲[16]。抵抗病原體共生的一種防御方式是通過病原體相關(guān)分子模式或含有脂多糖、脂質(zhì)A、鞭毛、細(xì)菌DNA和RNA這些菌群組分的微生物相關(guān)分子模式激活宿主先天免疫。MyD88-/-小鼠體內(nèi)Paneth細(xì)胞在小腸中產(chǎn)生AMPs減少，導(dǎo)致腸系膜淋巴結(jié)中共生細(xì)菌的定殖增加，也致使沙門氏病原菌向脾臟中的傳播增加[17]。有研究表示，革蘭陰性擬桿菌和革蘭陽性乳酸桿菌這幾類共生細(xì)菌通常能產(chǎn)生AMPs，其AMPs家族中分泌的C型凝集素的RegⅢ-γ在mRNA水平表達顯著增加[18]。Ivanov等[19]發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠單獨定殖共生菌SFB時能夠誘導(dǎo)腸黏膜固有層中的Th17細(xì)胞產(chǎn)生其效應(yīng)因子IL-22和IL-17。SFB聯(lián)合病原菌檸檬酸桿菌定殖的小鼠可明顯減少病原菌的侵襲能力。

2 腸道菌群引發(fā)腸癌原因

2.1 細(xì)菌來源的基因毒素和其他細(xì)菌毒力因子

在生物個體系統(tǒng)發(fā)育進化過程中，細(xì)菌逐漸獲得了具有致病性的毒素。例如，細(xì)菌發(fā)展了特別是通過使用鞭毛、菌毛和黏附素來穿透腸黏膜屏障的能力，以及黏附和侵入腸上皮細(xì)胞的能力，病原體對大多數(shù)疾病促進和致癌作用依賴于這些毒素。 病原體可與黏附分子相互作用，核梭桿菌利用FadA毒力因子黏附和侵入細(xì)胞，從而激活β-catenin信號通路并引發(fā)CRC[20]。調(diào)節(jié)真核細(xì)胞周期的細(xì)菌毒素(Cyclomodulins)，包括細(xì)胞致死毒素(Cytolethal distending toxin，CDT)、黏菌素、細(xì)胞毒性壞死因子和周期抑制因子，可誘導(dǎo)DNA損傷，干擾細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡[21]。CDT可促發(fā)菌群腸道定殖并誘導(dǎo)促炎分子NF-κB、腫瘤壞死因子、IL-6和環(huán)加氧酶2的產(chǎn)生從而參與致癌過程。黏菌素是另一種細(xì)菌基因毒素，其合成和活化需要復(fù)雜的機制，黏菌素誘導(dǎo)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)形成，DNA雙鏈斷裂，以及細(xì)胞周期停滯和基因組不穩(wěn)定[22]。此外，產(chǎn)生黏菌素的E.coli可促使上皮細(xì)胞分泌生長因子并通過浸潤細(xì)胞分泌促腫瘤分子來刺激腫瘤細(xì)胞增殖[23]。

2.2 微生物源代謝的致癌作用

影響CRC發(fā)生發(fā)展的因素除了細(xì)菌毒素外，菌群代謝致癌的作用也越來越明顯。高脂肪飲食與膽汁分泌增加可促進CRC風(fēng)險，這些酸不僅為菌群提供一定能量，同時也可參與CRC發(fā)展的相關(guān)過程，如細(xì)胞凋亡、增殖、DNA損傷誘導(dǎo)和腫瘤惡化[24]。小鼠模型中暴露于膽汁酸的腸道，其腫瘤的發(fā)生率較高[25]。細(xì)菌轉(zhuǎn)化的膽汁酸可以通過產(chǎn)生促氧化分子，如ROS和氮物質(zhì)(NOS)導(dǎo)致DNA損傷。因此，長期接觸二級膽汁酸可誘導(dǎo)DNA損傷，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，此外，膽汁酸可使腸道菌群組成顯著改變，其中與CRC發(fā)生密切相關(guān)的γ變形菌與擬桿菌數(shù)量會相對增加。一些致癌物質(zhì)在肝臟中通過葡萄糖醛酸的介導(dǎo)而失活，并通過膽汁排泄至消化道。在腸道中，特別是在結(jié)腸中，該過程由于細(xì)菌β-葡糖醛酸糖苷酶的活化而逆轉(zhuǎn)，并導(dǎo)致CRC的發(fā)生。CRC大鼠模型中腫瘤數(shù)量的減少與細(xì)菌β-葡萄糖醛酸酶活性被抑制有密切關(guān)系[26]。此外，較健康樣本，CRC患者的糞便中存在更多具有活性的β-葡萄糖醛酸酶[27]。

2.3 免疫調(diào)節(jié)與慢性炎癥

腸黏膜構(gòu)成了對抗腸道微生物的第一道防線，維持腸道穩(wěn)態(tài)涉及多種先天免疫受體，例如Toll樣受體(TLR)和Nod樣受體(NLR)，這些受體介導(dǎo)激活下游MAPK，NF-κB或PI3K/AKT信號通路[28]，并誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子表達，例如TNF-α、IL-6、IL-8，增強炎癥反應(yīng)。目前已確定，具有增加的CRC發(fā)生風(fēng)險的炎性腸病患者腸道菌群平衡會發(fā)生改變[29]，由腸道穩(wěn)態(tài)失調(diào)所引起的炎癥與腸癌發(fā)生密切相關(guān)。體內(nèi)實驗表明，腸道菌群的改變可引起腸癌治療過程中腸道穩(wěn)態(tài)的變化[30]。在CRC發(fā)生發(fā)展過程中，腸道炎癥也可能與腸道細(xì)菌誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)有關(guān)[31]。感染糞腸球菌的CRC小鼠模型中腫瘤和結(jié)腸黏膜免疫細(xì)胞浸潤增強 TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 的表達上調(diào)[32]。E.coli是與炎癥性腸病相關(guān)的特征性細(xì)菌之一，其在炎癥性腸病患者腸黏膜的定殖異常，并可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞環(huán)氧合酶2(COX-2)表達，參與結(jié)直腸癌發(fā)生中的腸道炎癥反應(yīng)[33]。

2.4 菌群參與CRC信號通路

腸道菌群對腸道免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)具有深遠的影響。目前已有大量文獻提示菌群組分既可以引發(fā)炎癥，又可調(diào)節(jié)腸固有層內(nèi)的免疫細(xì)胞[11,24,33]。同時腸道的正常發(fā)生發(fā)展過程會受到菌群的影響，正常腸道中隱窩中腸干細(xì)胞常常會受菌群內(nèi)毒素等物質(zhì)的刺激發(fā)生不可控的增殖反應(yīng)，如當(dāng)受到環(huán)氧合酶COX-2的激活或者生長因子15-PGDH的抑制將引發(fā)MMR(MLH1、MSH2、MSH6)上調(diào)以及APC和β-catenin的下調(diào)，腸道上皮開始增生，直至形成腺瘤時CIN、KRAS和BEAF受到影響，當(dāng)TGF-β、MAPK等信號通路被抑制時，伴隨PTEN缺失及PIK3CA的上調(diào)，同時TP53、BAX、SMAD4和TGFBR2等下調(diào)激活腫瘤細(xì)胞增殖。

CRC中由EGFR介導(dǎo)的主要信號通路為RAS-RAF-MAPK與PI3K-PTEN-AKT，兩條通路激活均可引起細(xì)胞增殖，抑制凋亡。目前已明確的耐藥機制，無論是信號分子突變(RAS、RAF、PI3K)還是旁路受體擴增(MET、HER2)，尚不能完全闡明抗EGFR靶向治療中原發(fā)與繼發(fā)耐藥產(chǎn)生的原因。更為關(guān)鍵的是耐藥一旦形成，菌群所引發(fā)的信號通路可以避開抗EGFR靶向藥物的封閉作用而活化，患者往往不能繼續(xù)從抗EGFR靶向治療中獲益。

2.5 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激的定義是活性氧分子(ROS和NOS)水平與抗氧化防御功能之間的平衡失調(diào)，導(dǎo)致由活性氧分子介導(dǎo)的不可逆的細(xì)胞損傷，包括DNA斷裂、突變、蛋白質(zhì)聚集或降解，以及細(xì)胞膜功能障礙。ROS的產(chǎn)生在CRC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，ROS可以在感染和炎癥期間的細(xì)胞產(chǎn)生，或直接由腸道菌群產(chǎn)生。受感染細(xì)胞誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生是腸道主要防御機制之一，有助于清除細(xì)菌[34]。體內(nèi)體外實驗表明，一些腸球菌屬物種可產(chǎn)生羥基自由基等活性氧物質(zhì)[35]，可導(dǎo)致DNA斷裂，點突變及蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)，增強CRC相關(guān)基因不穩(wěn)定[36]。幽門螺桿菌通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激致胃癌發(fā)生已得到明確證實[37]，幽門螺桿菌能通過誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生ROS，影響細(xì)胞中的許多信號通路，從而促進胃癌發(fā)生。細(xì)菌及炎癥誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集，這些炎性細(xì)胞是ROS的主要來源，參與腸癌發(fā)生過程中表觀遺傳改變[38]。腸道菌群還能促進宿主產(chǎn)生一氧化氮及NOS的產(chǎn)生，可以誘導(dǎo)DNA損傷[39]。

3 腸道菌群與腸癌防治

3.1 腸癌預(yù)防

小鼠和人類模型中已有很多研究證實調(diào)節(jié)腸道菌群可以預(yù)防CRC發(fā)生和進展，這其中涉及多種機制，通過體內(nèi)體外實驗表明體外益生菌移植可通過競爭作用減少致病性腸道菌群，同時也可以改變腸道內(nèi)多種酶的活性，并減少腸道內(nèi)致癌性膽汁酸，增加SCFAs產(chǎn)量[40]。體外實驗表明腸道菌群移植可以有效減少腸黏膜DNA損傷，并有助于維持腸道屏障功能[41]。腸道菌群移植可以不同程度緩解CRC相關(guān)癌前病變，對腸癌及息肉切除術(shù)患者給予富含低聚果糖、鼠李糖及乳酸雙歧桿菌Bb12[42]，經(jīng)過12周的干預(yù)，取組織活檢進行生物標(biāo)記測試、毒性分析發(fā)現(xiàn)移植菌群有效抑制了腸黏膜增殖，腸道細(xì)胞壞死明顯減少，上皮屏障功能得到改善。通過對樣本進行分析發(fā)現(xiàn)，接受干預(yù)患者體內(nèi)干擾素γ明顯升高，多種原癌基因表達下調(diào)[43]。

3.2 緩解腸癌治療不良反應(yīng)

動物實驗證實，腸道菌群移植可以有效減輕癌癥治療的不良胃腸道影響。當(dāng)實驗小鼠腹腔注射5-FU可引起腹瀉癥狀，腸道益生菌懸液干預(yù)小鼠癥狀有所改善。進一步研究表明，受試小鼠腸絨毛損傷減少，腸道組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達減少[42]。另一項研究中，給予益生菌干預(yù)由伊立替康引發(fā)受試小鼠的體重減輕及腹瀉等不良反應(yīng)明顯緩解，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)其腸黏膜損傷明顯減輕[44]。對接受伊立替康治療的CRC患者進行多種腸道菌群移植，結(jié)果表明接受菌群移植的患者嚴(yán)重腹瀉頻率降低，止瀉藥物的使用明顯減少[45]。另有臨床試驗評估了150名接受5-FU治療的CRC患者中，化療期間接受鼠李糖乳桿菌治療的患者的死亡率降低，4級腹瀉的發(fā)生率下降，腹部不適減少，同時接受干預(yù)患者化療劑量也明顯減少[46]。菌群移植也可減少放射治療副作用。研究表明，腸道菌群與輻射損傷程度相關(guān)，可促進腸黏膜修復(fù)的作用[47]。同時也可作為手術(shù)輔助治療，對168名術(shù)后CRC患者進行評估的研究中發(fā)現(xiàn)，接受益生菌干預(yù)患者與安慰劑組相比術(shù)后主要并發(fā)癥的發(fā)生率顯著降低[48]。

3.3 腸道菌群影響CRC治療效果

臨床癌癥治療研究中發(fā)現(xiàn)，某些患者受益于特定的治療方案，而其他具有相似流行病學(xué)和臨床特征的患者則不會。CRC患者腸道菌群可在接受治療過程中發(fā)揮重要作用。最近的一項體外研究表明，植物乳桿菌可調(diào)節(jié)5-FU耐藥腸癌細(xì)胞中某些癌癥特異性標(biāo)志物(CD44、133、166和LDH1)的表達，聯(lián)合使用植物乳桿菌和5-FU對細(xì)胞進行干預(yù)可促進Caspase誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，Wnt信號通路失活，進而增強5-FU的抗腫瘤作用[49]。另外，腸道菌群與腫瘤免疫治療效果密切相關(guān)[50]。雖然目前這些研究的結(jié)果不能直接應(yīng)用于臨床，但可明確許多癌癥治療的有效性可能部分依賴于菌群的功能。由此可以推測，某些抗生素的使用可能會減弱抗癌藥物的效果。

4 展 望

目前人們對微生物群體的認(rèn)識還停留在比較初級的認(rèn)識階段，即使菌群對人類健康至關(guān)重要，但無法確定“健康”的人類菌群外觀。某些功能，如調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和腸道黏膜屏障是有益的，但事實上還有大量關(guān)鍵的菌群功能尚未被發(fā)現(xiàn)。

通過調(diào)節(jié)腸道菌群方式可以對腸道、免疫系統(tǒng)和菌群間的交互產(chǎn)生重要的影響，且腸道菌群的代謝行為可產(chǎn)生SCFAs，抑制產(chǎn)生毒素的病原體，抗增殖活性，減少異常隱窩病灶同時增強抗氧化酶的產(chǎn)生來對CRC產(chǎn)生保護作用。此外，也應(yīng)考慮鑒定與臨床或菌群相關(guān)的其他微生物作為預(yù)測免疫療法反應(yīng)的生物標(biāo)志物。

當(dāng)腸道黏膜存在炎癥或破損時，黏膜細(xì)胞表面的受體蛋白、黏膜組織的滲透性發(fā)生改變，已吞噬細(xì)菌的巨噬細(xì)胞和已識別代謝產(chǎn)物的DCs無法將信號因子傳遞給嗜中性粒細(xì)胞，TNF-α或ROS無法被誘導(dǎo)，炎癥細(xì)胞無法被殺死，從而引發(fā)促炎因子的過表達，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子促進IL-17的分泌，繼而造成免疫反應(yīng)促使腸道癌變，導(dǎo)致動物腸腔內(nèi)皮增生、IL-18過表達。菌群在腸道內(nèi)對腸道細(xì)胞各信號通路中的蛋白影響甚多，如MAPK中的ERK2、JNK及p38a蛋白水平在不同菌群影響下會出現(xiàn)表達量的顯著差異。針對菌群的大部分研究都是在動物模型中進行的，而來自人類的臨床試驗研究數(shù)據(jù)，迄今為止結(jié)果仍不一致。

綜上所述，腸道菌群與CRC發(fā)生發(fā)展之間的相關(guān)性日趨明確，為CRC的預(yù)防與治療提供了新的研究方向。評估腸道微生物組的研究表明，其與結(jié)直腸癌的發(fā)病機制和治療之間存在緊密的聯(lián)系。有必要在人類受試者(如糞便移植實驗)中進一步進行轉(zhuǎn)化研究和臨床試驗，以操控微生物組改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后的可能性。