王恒

摘 要：為了提高伯克霍爾德氏菌Burkholderia sp.ZYB002發(fā)酵液降解馬尾松樹脂的效價，對培養(yǎng)基進行優(yōu)化。通過單因素試驗確定1%葡萄糖為發(fā)酵最適碳源、0.3%尿素和2%玉米粉為最適復(fù)合氮源。采用響應(yīng)面法得到3種主控因子最佳配比：葡萄糖0.576%、橄欖油1.81%、接種量2.57%，優(yōu)化后降解馬尾松樹脂的效價提高到42.5%;運用BPGA耦合法得到最佳配比：葡萄糖0.6763%、橄欖油1.8034%、接種量3.3813%，優(yōu)化后馬尾松樹脂的降解效價提高到47.4%。結(jié)果還表明：BPGA耦合法較響應(yīng)面更具優(yōu)化效應(yīng)，優(yōu)化后比初始降解效價提高了38.6%。通過BPGA耦合法優(yōu)化后，Burkholderia sp.ZYB002菌株的搖瓶發(fā)酵最佳培養(yǎng)基組成為： 葡萄糖0.6763%、玉米粉1.2%、橄欖油1.8034%、尿素（氮含量）0.05%、K2HPO4 0.2%、NaHCO3 0.1%、吐溫80 1.0%、初始pH 8.5。培養(yǎng)條件：發(fā)酵溫度為30℃，接種量3.3813%，搖床轉(zhuǎn)速 220 r·min-1，裝液量 35 mL（250 mL三角瓶），培養(yǎng)時間 36 h。

關(guān)鍵詞：馬尾松樹脂;響應(yīng)面;神經(jīng)網(wǎng)絡(luò);遺傳算法;培養(yǎng)基優(yōu)化

Abstract： In order to improve the titer of Pinus massoniana resin degraded by the fermentation broth of Burkholderia sp.ZYB002， the medium was optimized. The single factor experiment was carried out to determine that 1% glucose was the most suitable carbon source for the fermentation， 0.3% urea and 2% corn flour were the most suitable compound nitrogen sources. The response surface method was used to obtain the optimal ratio of the three main control factors： glucose 0.576%， olive oil 1.81% and inoculation quantity 2.57%. After the optimization， the degradation titer of Pinus massoniana resin was increased to 42.5%. While the optimal ratio was obtained by the BPGA coupled method： glucose 0.6763%， olive oil 1.8034%， inoculation quantity 3.3813%. After the optimization， the degradation titer of Pinus massoniana resin was increased to 47.4%. The results also showed that compared with the response surface method， the BPGA coupled method had the better optimization effect， and the titer after the optimization was improved by 38.6% compared with the initial degradation titer. After the optimization by the BPGA coupled method， the optimal medium composition for the shakeflask fermentation of Burkholderia sp.ZYB002 was： glucose 0.6763%， corn flour 1.2%， olive oil 1.8034%， urea （nitrogen content） 0.05%， K2HPO4 0.2%， NaHCO3 0.1%， Tween 80 1.0%， and initial pH 8.5. The culture condition was as follows： the fermentation temperature was 30℃， the inoculation quantity was 3.3813%， the shaking speed was 220 r·min-1， the loaded liquid was 35 mL（250 mL triangular flask）， and the culture time was 36 h.

Key words： Pinus massoniana resin; Response surface; Neural network; Genetic algorithm; Culture medium optimization

通常木材中含有一些脂肪酸、樹脂酸、甘油三酸酯以及不皂化的化合物等脂溶性物質(zhì)，依據(jù)樹種、環(huán)境和季節(jié)的不同，這些脂溶性物質(zhì)約占木材總量的2%～8%[1]，在馬尾松中的含量一般在4%以上[2]。在造紙制漿的過程中，這些不溶于水的脂溶性物質(zhì)會被游離出來，當紙漿中的溫度和pH值下降到一定程度時，黏附在金屬和紙張上，從而對輸送紙漿管道、抄紙工藝以及整個回水的循環(huán)利用過程造成不利的影響，還會造成紙張有斑點破洞或引起紙幅斷頭等，這些危害稱為樹脂障礙[3-4]。目前解決樹脂障礙的方法主要有木材陳良法[5]、化學控制法[6]、微生物法[7]和生物酶法[8]等。生物酶法（脂肪酶）具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)保，并且能夠從根本上將樹脂降解成水溶性較強的脂肪酸和甘油[8-9]。本課題采用的伯克霍爾德氏菌Burkholderia sp.ZYB002是張巖峰[10]篩選的產(chǎn)脂肪酶菌株，利用該菌株的發(fā)酵液來降解樹脂，可省去純脂肪酶的制備過程，發(fā)酵液中本身帶有以脂肪酶為主導的酶系，可能會收到更好的降解樹脂效果。

該方程的相關(guān)性系數(shù)Rsquare為92.74%，說明該模型與實際的降解率擬合良好，可以用于降解馬尾松樹脂效價的分析和預(yù)測。由表6可知，交互項X8×X10的系數(shù)和均方差較大，X1×X8、X1×X10的系數(shù)和均方差較小，說明因素X8和X10相互影響較大，X1與X8、X10的相互影響較小。通過分析可知，該模型Pr>F的概率為 0.0220，說明該回歸方程具有可靠性。

由圖3可以看出X8、X10存在極值點，進行嶺分析，回歸方程模型中存在最優(yōu)點（-0.20080，0.66206，-0.72205 ），實際值即葡萄糖0.576%，橄欖油1.81% ，接種量2.57%，相對應(yīng)的Y最大估計值為45.9191±0.46506。為了驗證模型分析中最大預(yù)測值，最優(yōu)點組合做了3組重復(fù)試驗。

2.5 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與遺傳算法耦合優(yōu)化分析

2.5.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立 通用 MATLAB 軟件反復(fù)的測試發(fā)現(xiàn)隱含層數(shù)為1，神經(jīng)元個數(shù)為9時，能精確地擬合試驗數(shù)據(jù)，因此神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)為 3-9-1。將輸入層-隱藏層傳遞函數(shù)設(shè)定為tansig函數(shù)，訓練函數(shù)設(shè)定為traingdm函數(shù)，為減少訓練時間，先對樣本進行歸一化處理，收斂精度取10-5，最大訓練步數(shù)設(shè)定為8000，在此基礎(chǔ)上建立發(fā)酵培養(yǎng)基的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。由建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測值為42.7%，實測值為44.1%，相對誤差百分比為3.28%，說明建立的模型泛化能力強，可以用于對試驗數(shù)據(jù)進行預(yù)測。

2.5.2 遺傳算法對BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化結(jié)果 通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)正確的輸入輸出映射關(guān)系，將神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸出作為求解目標函數(shù)值，利用遺傳算法對發(fā)酵培養(yǎng)基進行全局尋優(yōu)[11]，從而獲得最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基組合，實現(xiàn)馬尾松樹脂降解率的提高。通過MATLAB軟件編程，將遺傳算法的初始種群設(shè)定為40，交叉概率為0.8，變異概率0.05，終止代數(shù)100。遺傳算法尋優(yōu)結(jié)果如圖4所示，通過迭代30次，適度函數(shù)值趨于穩(wěn)定，GA找到了模型的最大值。

2.5.3 優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵檢測 使用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)-遺傳算法耦合模型對發(fā)酵培養(yǎng)基進行全局尋優(yōu)，得到最優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成（葡萄糖0.6763%、橄欖油1.8034%、接種量3.3813%），根據(jù)BP模型預(yù)測該組合的降解率為46.5%，實測值為47.4%。同時與原始培養(yǎng)基、響應(yīng)面優(yōu)化的培養(yǎng)基進行橫向?qū)Ρ?，結(jié)果如表7所示。分析表明，用BPGA耦合法優(yōu)化的培養(yǎng)基馬尾松樹脂的降解率和BP預(yù)測值間的誤差小于2%;而用響應(yīng)面法的預(yù)測值（45.9%）與實際值（42.5%）之間誤差達到7.41%，這說明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模法非常適合該發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，具有較高的仿真精度。

3 討論與結(jié)論

在單因子試驗中確立了葡萄糖為最佳碳源，尿素和玉米粉作為復(fù)合氮源。然后利用響應(yīng)面法和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)遺傳算法耦合法對Burkholderia sp.ZYB002菌株發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，分別比原始培養(yǎng)基提高了24.3%、38.6%，表明BPGA耦合法比響應(yīng)面法在該發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中更加顯著。由于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)有很強的輸入輸出非線性映射能力，具有較高的仿真精度，能夠很精確地擬合樹脂降解率與培養(yǎng)基主要組分之間的內(nèi)在聯(lián)系，再加上遺傳算法具有迅速全局尋優(yōu)能力，因此利用BPGA耦合方法進行Burkholderia sp.ZYB002發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化是一種行之有效的途徑。

通過BPGA耦合法優(yōu)化后，Burkholderia sp.ZYB002菌株的搖瓶發(fā)酵最佳培養(yǎng)基組成為：葡萄糖0.6763%、玉米粉1.2%、橄欖油1.8034%、尿素（氮含量）0.05%、K2HPO4 0.2%、NaHCO3 0.1%、吐溫80 1.0%、初始pH 8.5。培養(yǎng)條件：發(fā)酵溫度為30℃，接種量3.3813%，搖床轉(zhuǎn)速 220 r·min-1，裝液量 35 mL（250 mL三角瓶），培養(yǎng)時間 36 h。

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（責任編輯：柯文輝）