孫金　翁麗麗　肖春萍　姜雨昕　宿瑩　劉戰(zhàn)　吳曉燕

中圖分類號 R284.1;R927.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）11-1314-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.11.06

摘 要 目的：建立同時測定北蒼術中白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮含量的方法，并結合色差原理評價不同生長年限北蒼術藥材的質量。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法進行測定，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18，流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長分別為208 nm（白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇）、340 nm（蒼術素）和220 nm（蒼術酮），進樣量為15 μL。以蒼術素為內參物，采用一測多評法建立白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術酮的相對校正因子，并計算不同生長年限北蒼術藥材中各成分的含量;同時，采用外標法測定上述成分含量，并與一測多評法結果進行比較?；谏钤韺Σ煌L年限北蒼術藥材粉末進行顏色測定，采用Pearson相關分析法對蒼術藥材中上述4種成分含量與其顏色進行相關性分析。 結果：白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮的分離度均大于1.5，檢測質量濃度線性范圍分別為1.01～10.10、3.30～33.00、4.40～44.00、5.34～53.40 μg/mL，精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗的RSD均小于2%，平均加樣回收率為101.34%～104.67%（RSD<1.5%， n=6）;以蒼術素為內參物，白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術酮的平均校正因子分別為3.896 7、5.928 2、9.727 9，RSD分別為0.35%、2.89%、0.36%（n=6）。采用一測多評法與外標法測得的24批北蒼術藥材中3種成分（除蒼術素外）含量的相對偏差在0.03%～1.45%之間，表明2種方法測定結果一致，且各成分含量隨藥材生長年限的增加而升高。北蒼術藥材中白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮與其顏色亮度（L*）、色差值（E*ab）呈顯著負相關（P<0.01），與紅綠色度（a*）、黃藍色度（b*）呈顯著正相關（P<0.01）。結論：HPLC-一測多評法可用于北蒼術藥材中白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮的含量測定;藥材生長年限越長，各成分含量越高;藥材顏色與各成分含量顯著相關，且顏色偏暗黃棕色的北蒼術藥材的有效成分含量較高。

關鍵詞 北蒼術;高效液相色譜法;一測多評法;色差原理;含量測定;質量評價

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To simultaneously determine the contents of atractylenolide Ⅱ， β-eudesmol， atractyloxin and atractylone in Atractylodes chinensis， and to evaluate the quality of A. chinensis with different growth years combined with color difference principle. METHODS： HPLC method was adopted. The determination performed on Agilent Eclipse XDB-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min; the detection wavelengths were set as 208 nm （atractylenolide Ⅱ， β-eudesmol）， 340 nm （atractyloxin） and 220 nm （atractylone）; the sample size was 15 μL. Using atractyloxin as reference， QAMS was adopted to establish relative correction factors （RCFs） of atractylenolideⅡ， β-eudesmol and atractylone; the content of each component in A. chinensis with different growth years were calculated. The contents of above 4 components were determined by external standard method and then compared with the results of QAMS. The color difference values of A. chinensis powder were measured based on color difference principle. The correlation analysis of above 4 components content with color was carried out by Pearson correlation analysis. RESULTS： The separation degree of atractylenolide Ⅱ， β-eudesmol， atractyloxin and atractylone in A. chinensis was higher than 1.5. The linear range were 1.01-10.10， 3.30-33.00， 4.40-44.00， 5.34-53.40 μg/mL， respectively. RSDs of precision， reproducibility and stability tests were all lower than 2%， while the average recovery rates were 101.34%-104.67% （RSD<1.5%， n=6）. Using atractyloxin as reference， RCFs of atractylenolide Ⅱ， β-eudesmol and atractylone were 3.896 7， 5.928 2， 9.727 9， with RSD of 0.35%， 2.89%， 0.36% （n=6）， respectively. Relative deviation of 3 components （except for atractyloxin） in 24 batches of A. chinensis ranged 0.03%-1.45% between QAMS and external standard method， which indicated that the results of two methods were consistent， and the content of each component increased with the increase of growth years. Atractylenolide Ⅱ， β-eudesmol， atractyloxin and atractylone in A. chinensis had significant negative correlation with its color shade （L*）， total color difference （E*ab） （P<0.01）， and significant positive correlation with color red-green direction （a*）， color yellow-blue direction （b*） （P<0.01）. CONCLUSIONS： The established HPLC-QAMS method can be used for the determination of atractylenolide Ⅱ， β-eudesmol， atractyloxin and atractylone in A. chinensis. The longer the growth period is， the higher each component content is. The color of A. chinensis is closely related to the content of each component， and the content of effective components is higher in A. chinensis with dark yellowish brown color.

KEYWORDS? ?Atractylodes chinensis; HPLC; QAMS; Color difference principle; Content determination; Quality evaluation

蒼術[Atractylodes chinensis （DC.） Koidz.]為菊科多年生草本植物，以其干燥根莖入藥，是2015年版《中國藥典》（一部）中收載的蒼術藥材的來源之一[1]?！侗静菥V目》《金匱要略》中均以“赤術”記載[2]。蒼術根據(jù)性狀和產地可分為北蒼術、茅蒼術、關蒼術，其中北蒼術中主要有效成分為蒼術素、β-桉葉醇、蒼術酮、白術內酯Ⅱ等，具有燥濕健脾、祛風散寒、明目等多種功效[3]，其有效物質含量會受到土壤、水源等因素的影響[4]?！吨袊幍洹芬?guī)定蒼術中蒼術素含量不得低于0.3%[1]。相關研究表明，絕大部分北蒼術和茅蒼術中的蒼術素含量高于標準，而關蒼術含有微量或不含有蒼術素，與《中國藥典》對蒼術藥材來源的規(guī)定相一致[5-6]。另外，北蒼術中蒼術素含量普遍高于茅蒼術[7]，而傳統(tǒng)認為茅蒼術質量優(yōu)于北蒼術，表明蒼術素含量的高低不能全面地反映蒼術質量。北蒼術根莖中主要成分包括聚乙炔類和倍半萜類，其中，聚乙炔類成分主要為蒼術素，倍半萜類成分主要為β-桉葉醇、蒼術酮、白術內酯Ⅱ等[8-10]。基于此，本研究建立這4種成分的高效液相色譜（HPLC）-一測多評法，以對北蒼術質量進行綜合評價。另外，中藥顏色一直是傳統(tǒng)性狀評價中的重要因素，顏色的差異往往反映著藥材質量的不同，與藥材內在物質成分含量高低也密切相關[11]。由于傳統(tǒng)的顏色評價多為人眼直接觀察，有很大的主觀性和模糊性[12]。所以，筆者基于色差原理建立一種客觀的、數(shù)字化的顏色評價方法，來實現(xiàn)對中藥顏色的量化評價，以便更加準確地分析中藥內在質量，并為建立較完善的北蒼術質量評價體系提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC2030型HPLC儀（日本島津公司）;1260型HPLC儀（美國Agilent公司）;FA1004B電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）;NH310型色差儀（深圳市三恩馳科技有限公司）;KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

白術內酯Ⅱ對照品（批號：M22A10S95762，純度：99.9%）、β-桉葉醇對照品（批號：P24O8F46474，純度：99.4%）、蒼術素對照品（批號：180210-004，純度：99.7%）、蒼術酮對照品（批號：P11M10F73437，純度：97.3%）均購自上海源葉生物科技有限公司;磷酸、乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

24批北蒼術藥材經長春中醫(yī)藥大學藥學院翁麗麗教授鑒定均為菊科植物北蒼術[A. chinensis （DC.） Koidz.]的干燥根莖，其來源信息詳見表1。

2 方法與結果

2.1 HPLC-一測多評法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～3 min，55%A;3～20 min，55%A→60%A;20～35 min，60%A→65%A;35～55 min，65%A→85%A;55～60 min，85%A→95%A）;檢測波長分別為208 nm（白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇，0～28 min）、340 nm（蒼術素，28～45 min）、220 nm（蒼術酮，45～60 min）;流速為1 mL/min;柱溫為32 ℃;進樣量為15 μL。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮對照品適量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解制成質量濃度分別為10.1、33.0、44.0、53.4 μg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 將北蒼術藥材粉碎后過三號篩，精密稱定藥材粉末0.3 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理1 h，放冷，再次稱定，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 專屬性試驗 取“2.1.2”和“2.1.3”項下混合對照品溶液、供試品溶液（編號：S8）和空白溶劑（甲醇），按“2.1.1”項下色譜條件進行測定。結果，各待測成分均達到基線分離，白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮的理論板數(shù)均大于10 000，與各相鄰峰間分離度均大于1.5，且溶劑無干擾（圖略）。高效液相色譜圖見圖1。

2.1.5 線性關系考察 分別精密量取“2.1.2”項下混合對照品溶液2.0、1.8、1.2、0.8、0.4、0.2 mL，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成系列線性溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。以峰面積為縱坐標（y）、質量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸。結果，白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮的線性范圍分別為1.01～10.10、3.30～33.00、4.40～44.00、5.34～53.40 μg/mL（r≥0.999 8），詳見表2。

2.1.6 精密度試驗 取北蒼術藥材（編號：S8）粉末適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，然后就按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。結果，白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮峰面積的RSD均小于0.3%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 取北蒼術藥材（編號：S8）粉末適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并以外標法計算各待測成分含量。結果，白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮的平均含量分別為0.283 6、0.503 4、2.878 1、1.791 8 mg/g，RSD均小于1.8%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取北蒼術藥材（編號：S8）粉末適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，于室溫下密閉放置0、2、4、8、12、24、48 h后，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮峰面積的RSD均小于0.7%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的北蒼術藥材（編號：S8，白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮的含量分別為0.283 6、0.503 4、2.878 1、1.791 8 mg/g）粉末0.3 g，置于具塞錐形瓶中，平行制備6份。每份樣品中均分別加入白術內酯對照品Ⅱ 0.106 2 mg、β-桉葉醇對照品0.177 9 mg、蒼術素0.973 1 mg、蒼術酮0.537 1 mg，然后再加甲醇至50 mL，按“2.1.3”項下方法中“密塞，稱定質量……取續(xù)濾液”等步驟操作，制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以外標法計算各待測成分含量并以此計算加樣回收率。結果，白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮的平均加樣回收率分別為102.43%、104.67%、101.34%、103.72%，RSD均小于1.5%（n=6），表明方法準確度良好，詳見表3。

2.1.10 相對校正因子及相對保留時間的計算 分別精密吸取“2.1.2”項下的混合對照品溶液1、3、7、10、15、20 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算相對校正因子（fk/s）及相對保留時間（tk/s）。其中，fk/s=（Ws×Ak）/（Wk×As），式中Ws為內參物進樣量，As為內參物峰面積，Wk為成分k的進樣量，Ak為成分k的峰面積;tk/s=tk/ts，式中tk為成分k的保留時間，ts為內參物的保留時間。本試驗以蒼術素為內參物，結果，白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術酮的平均fk/s分別為3.896 7、5.928 2、9.727 9，RSD分別為0.35%、2.89%、0.36%（n=6）;平均tk/s分別為0.491 7、0.834 8、1.683 3，RSD分別為0.12%、0.01%、0.03%（n=6），詳見表4。

2.1.11 系統(tǒng)耐用性考察 采用不同高效液相色譜系統(tǒng)（Shimaduz LC-2030、Agilent 1260）和色譜柱（Agilent XDB-C18、Angela Innoval C18、依利特ODS-C18），考察其對fk/s和tk/s的影響。結果，不同高效液相色譜系統(tǒng)和色譜柱條件下，白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術酮的fk/s和tk/s的RSD均小于2%（n=6），詳見表5。

2.1.12 一測多評法與外標法比較 取24批北蒼術藥材，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，采用一測多評法對北蒼術中白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術酮進行含量測定（內參物蒼術素根據(jù)外標法計算），并與外標法測定的上述成分含量結果進行比較。每批樣品平行測定3次，結果取平均值。結果，2種方法測定24批北蒼術藥材中3種成分（除蒼術素外）含量的相對偏差（RE）在0.03%～1.45%之間，表明2種方法測定結果一致，且結果顯示各成分含量隨藥材生長年限的增加而升高，詳見表6。

2.2 基于色差原理分析北蒼術質量

2.2.1 色度測定條件 光源為D65，觀察角為8°，測定孔徑為8 mm，光源為LED藍光激發(fā)，儀器色差值誤差≤0.4。對儀器進行黑白板校正以后，進行樣品測定。

2.2.2 精密度試驗 取北蒼術藥材（編號：S8）粉末適量，均勻平鋪于自制測色皿底部，按“2.2.1”項下色度測定條件進行樣品顏色測定，連續(xù)測定6次，記錄顏色亮度（L*）、紅綠色度（a*）、黃藍色度（b*）。結果，北蒼術藥材的L*、a*、b*的RSD均小于2%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取北蒼術藥材（編號：S8）粉末適量，于室溫放置0、2、4、6、8、10 h后，按照“2.2.1”項下色度測定條件進行樣品顏色測定，記錄L*、a*、b*。結果，北蒼術藥材L*、a*、b*的RSD均小于3%（n=6），表明樣品在室溫下放置10 h內顏色穩(wěn)定性良好。

2.2.4 樣品顏色測定 取北蒼術藥材（編號：S8）粉末適量，按照“2.2.1”項下色度測定條件進行樣品顏色測定，每個樣品平行測定3次，記錄L*、a*、b*并取平均值，并計算色差值E*ab[E*ab=（L*2+a*2+b*2）1/2]，結果見表7。

2.3 不同生長年限北蒼術藥材中有效成分含量與顏色指標值的綜合分析

2.3.1 相關性分析 利用Pearson法分析不同生長年限北蒼術藥材中有效成分白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮含量與顏色指標值L*、a*、b*、E*ab的相關系數(shù)，結果見表8。

由表8可知，不同生長年限北蒼術藥材中白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮含量與顏色指標值L*、E*ab呈顯著負相關（P<0.01），與a*、b*呈顯著正相關（P<0.01），說明L*、E*ab值越小或a*、b*越大，北蒼術藥材中白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮含量越高。

2.3.2 回歸分析 利用SPSS 21.0軟件，以不同生長年限北蒼術藥材中白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮含量為因變量，以顏色指標值L*、a*、b*為自變量進行回歸分析，結果見表9～表11。

由表9可知，不同生長年限北蒼術藥材中白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮含量與顏色指標值L*、a*、b*的R2分別為0.869、0.583、0.982、0.800，說明北蒼術藥材中上述4種成分的含量分別在86.9%、58.3%、98.2%、80.0%的程度上可以通過色差值來反映。

由表10可知，不同生長年限北蒼術藥材中白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮的含量與顏色指標值所構成的回歸方程在統(tǒng)計學上是顯著的。

由表11可得回歸方程Y白術內酯Ⅱ含量=1.917-0.022L*-0.016a*-0.014b*;Yβ-桉葉醇含量=0.455-0.007L*+0.116a*-0.004b*;Y蒼術素含量=8.081-0.093L*-0.024a*-0.008b*;Y蒼術酮含量=-3.232+0.014L*+0.382a*+0.081b*。因此，可通過北蒼術藥材的顏色快速預測其白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮的含量。

3 討論

中藥成分的復雜多樣決定了單一成分的含量不能全面地反映藥材質量，必須采用多成分、多指標進行綜合質量分析[13]。近年來，運用外標法同時測定多種成分的評價方式可以更全面地闡明各成分間的相互關系，實現(xiàn)多成分的量化分析，但中藥成分對照品存在性質不穩(wěn)定、價格昂貴等問題，因此使得該方法具有一定的局限性[14]。而一測多評法可在缺少對照品的情況下，通過相對校正因子實現(xiàn)對多成分的含量測定[15]，在中藥質量評價上具有獨特的優(yōu)勢，為中藥多指標質量評價提供了新的研究思路和發(fā)展趨勢。本研究中蒼術素較其他幾種成分價格便宜，且為《中國藥典》規(guī)定的指標成分[1]，故選擇其作為內參物。基于此，筆者建立了HPLC-一測多評法同時測定北蒼術藥材中聚乙炔類成分蒼術素和倍半萜類成分白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術酮的含量。結果顯示，該方法準確性、含量穩(wěn)定性較好，且與外標法測定結果相一致，可對北蒼術進行多指標質量分析;且通過數(shù)據(jù)可知白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮含量隨藥材生長年限的增加而升高。

另外，本研究基于色差原理對不同生長年限北蒼術藥材的顏色進行量化分析，研究白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮含量與顏色指標值L*、a*、b*、E*ab的相關性。結果顯示，不同生長年限北蒼術藥材顏色與各成分含量顯著相關，在一定程度上顏色指標L*、E*ab越小或a*、b*越大，藥材中白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮含量越高，即顏色偏暗黃棕色的北蒼術藥材的有效成分含量較高。

綜上所述，本研究成功建立了HPLC-一測多評法測定北蒼術藥材中白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮的含量，結合色差原理可分析北蒼術藥材的質量變化與顏色的相關性，為更全面、準確地評價該藥材的質量提供了新手段，并可為其質量研究體系的建立和完善提供參考。

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（收稿日期：2020-01-02 修回日期：2020-03-17）

（編輯：唐曉蓮）