李柏謙 李鑒州 李海萍

廣州市從化區(qū)婦幼保健院兒科(廣州 510900)

人冠狀病毒OC43((human coronavirus OC43，HCoV-OC43))是冠狀病毒科的一種，是有包膜的單正鏈RNA病毒，在RNA病毒中具有最大的病毒基因組[1]。在人類中，冠狀病毒被證明可引起呼吸道感染，最常見的是上呼吸道感染，也可引起下呼吸道感染，也可以引起嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，包括嚴重的急性呼吸道綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)和中東呼吸綜合癥(Middle East Respiratory Syndrome，MERS)[2]。到目前為止，已經鑒定出六種HCoV類型，包括OC43、229E，NL63，HKU1，SARS-CoV和MERS-CoV[3- 4]。HCoV-OC43和HCoV-229E是最早些年被發(fā)現(xiàn)，主要引起人類普通感冒，據報道，最近幾年又發(fā)現(xiàn)的NL63和HKU1引起輕度呼吸道感染，這四種冠狀病毒也可以引起嚴重的下呼吸道感染，在患有基礎疾病的幼兒或老年人中[5]。HCoV-NL63與急性喉氣管炎有關[6]。SARS-CoV是一種2bβ冠狀病毒，導致嚴重的下呼吸道感染，高發(fā)病率和死亡率[7]。新型冠狀病毒MERS-CoV，它是一系列高致病性、高死亡率(20%～40%)的下呼吸道感染的病原體，主要是中東地區(qū)的流行病，但在2014年又在韓國爆發(fā)[8]。冠狀病毒由于其重組，變異和感染多種物種和細胞類型的能力而可能引起高暴發(fā)，因此，它們具有在物種間跳躍的傾向[9- 10]。到目前為止，沒有針對冠狀病毒的抗病毒療法，只有少數選擇預防冠狀病毒的感染。因此對HCoV流行病學的監(jiān)測和了解HCoV流行病學特征，對于HCoV感染的預防和控制非常重要。我們收集2017年1月—2019年6月期間在從化地區(qū)婦幼保健院門診就診的有呼吸道感染癥狀的兒童610例，進行咽喉和鼻拭子標本采集，并觀察呼吸道感染的多種病毒的流行病學特征和冠狀病毒基因特點，對臨床早期診斷和合理用藥具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇病例為2017年1月—2019年6月就診于廣州市從化區(qū)婦幼保健院兒科門診，診斷為急性上呼吸道感染和下呼吸道感染的患兒，共610例, 其中男390例，女220例。年齡在6月—14歲之間，610例患兒按年齡分為：嬰幼兒組(6月～3歲)415例，兒童組(3歲～14歲)195例，共2個年齡組。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，所有兒童或者父母得到書面知情同意書。

1.2 入組標準

樣本取自發(fā)熱≤4d(溫度≥37.5℃)且有鼻塞、流涕、咽痛、咳嗽、咳痰、喘息、呼吸困難和/或其他急性呼吸道感染癥狀的個體。經臨床確診為上呼吸道感染(急性咽炎、急性鼻炎、急性扁桃體炎)，下呼吸道感染(急性支氣管炎、支氣管肺炎)，其中急性咽炎68例、急性鼻炎53例、急性扁桃體炎106例；急性支氣管炎268例、支氣管肺炎115例，診斷標準：參照《諸福棠實用兒科學》第8版[11]。排除標準：年齡小于6個月和大于15歲兒童；嚴重心臟病患者；肺炎感染引起的并發(fā)癥患者；嚴重精神疾病患者。

1.3 標本收集

標本采集與檢測用植絨鼻咽拭子從患者的鼻咽部取樣，將鼻咽拭子放入無菌儲存管中(含2mL生理鹽水)，立即送檢。采用直接免疫熒光法檢測：流感病毒A(IVA)、流感病毒B(IVB)、副流感病毒Ⅰ(PIVⅠ)、副流感病毒Ⅱ(PIVⅡ)、副流感病毒Ⅲ(PIVⅢ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)，共7種呼吸道病毒抗原。采用熒光定量PCR方法，對HCoV-OC43病毒核酸進行分析和測序，同時對冠狀病毒的亞型也進行檢測，包括：HCoV-OC43，HCoV-229E， HCoV-NL63，HCoV-HKU1。

1.4 RT-PCR檢測冠狀病毒

按照試劑盒的說明操作，使用QIAamp MiniElute Virus Spin(德國QIAGEN)從200μL的喉嚨和鼻拭子樣本中提取病毒DNA和RNA。使用Thermo Scientific Revert Aid First絞鏈cDNA合成試劑盒(Thermo，USA)進行病毒RNA的反轉錄，過程為：25℃5min，42℃60min，然后70℃5min。cDNA可立即用于病毒檢測，或保存在-20℃下直至進一步使用。通過標準逆轉錄PCR(RT-PCR)檢測冠狀病毒，篩選HCoV和4種(OC43、229E，NL63，HKU1)。TaqMan實時PCR引物和探針(由Invitrogen，Life Technology，上海合成)被設計為結合高度保守的HCoV區(qū)域和相應物種，并通過Primer Express軟件(3.0版，美國應用生物系統(tǒng)公司)進行分析(用于引物)。每個反應混合物由10μL2×iQ Supermix反應混合物(Bio-Rad)，2μL病毒cDNA，0.5μM正向和反向引物以及0.3μM探針和無核酸酶的水組成體積為20μL。對于總HCoV，實時PCR在95℃下進行5min，然后在95℃下進行45次循環(huán)15s，在60℃下進行1min。對于物種229E / OC43/ NL63/ HKU1，在95℃下進行5min實時PCR，然后在95℃下進行45次循環(huán)15s，在55℃下進行1min。然后進行45個循環(huán)，分別是95℃持續(xù)30s，55℃15s，60℃45s。所有實時PCR反應均在ABI7500實時PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems)上進行。用于反應的引物如下，見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.5 HCoV-OC43 N基因的擴增和測序

對于HCoV-OC43的N基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析，通過Primer Premier 5.0軟件設計了3對引物，以結合相對保守的N基因區(qū)域。用于設計引物的參考序列包括GenBank數據庫中可用的來自不同地區(qū)和年份的15種代表性菌株。它們的GenBank登錄號為：NC_005147.1，AY585229.1，AY585228.1，KF530099.1，KF530098.1，KF530097.1，KF530096.1，KF530095.1，KF530093.1，KF530091.1，KP198611.1， KJ958218.1，JN129835.1，L14643.1和Z21849.1。引物是由中國上海的Invitrogen公司合成的。在準備的20 μL反應混合物中進行PCR，該混合物包括10 μL 2×Premix Ex Taq(Takara，大連，中國)，2 μL模板cDNA，正向和反向引物各0.5 μmol。PCR程序為：95℃持續(xù)5 min，然后進行35個循環(huán)：95℃持續(xù)30 s，50℃至55℃(有關不同引物的解鏈溫度，請參見表1)1 min和72℃ 1 min，最后在72℃延伸10 min。用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒(中國大連，Takara)純化用于測序的PCR產物，并將其克隆到PMD19-T載體(中國大連，Takara)中。用于克隆和測序的所有PCR產物均來自三個獨立的PCR反應。測序由中國上海的Invitrogen公司進行。用于測序的引物見表2。

表2 用于HCoV-OC43 N基因擴增和測序的PCR引物

1.6 病毒檢測 選用美國 Chemieon公司產品，采用直接熒光免疫法，對流感病毒 A、B型(influenza virus,IVA、B)、副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型 (parainfluenza virus, PIVⅠ、Ⅱ和Ⅲ)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、腺病毒(adenovirus, ADV)共七種常見呼吸道病毒進行檢測，通過奧林巴斯BX51熒光顯微鏡, 按試劑說明標準操作，觀察判斷結果 。

2 結 果

2.1 患者呼吸道感染病毒類型分布

參與觀察的610例患者中，其中男390例，女220例。嬰幼兒415(68.03%)例，平均年齡(2.15±0.27)歲，其中男嬰280例，女嬰135例。兒童195(31.97%)例，平均年齡(9.68±4.65)歲，其中男童110例，女童85例。各種常見病毒的發(fā)病情況，流感病毒A(IVA)111例(18.20%)、流感病毒B(IVB)61例(10.00%)、副流感病毒Ⅰ(PIVⅠ)42例(6.89%)、副流感病毒Ⅱ(PIVⅡ)34例(5.57%)、副流感病毒Ⅲ(PIVⅢ)77例(12.62%)、呼吸道合胞病毒(RSV)135例(22.14%)、腺病毒(ADV)82例(13.45%)，冠狀病毒(HCoV-OC43)68例(11.14%)。呼吸道感染多為流感病毒(A+B)和副流感病毒(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)共325例(53.28%)，其次是合胞病毒感染135例(22.14%)，腺病毒(ADV) 82例(13.45%)，冠狀病毒感染最低68例(11.14%)。見表3。

2.2 冠狀病毒HCoV各月份陽性率分布

統(tǒng)計2017—2019年總的HCoV的月份分布，可以看出，HCoV主要是在冬季和春季流行，但不同物種之間存在差異。HCoV-OC43全年均可檢出，春季(4月和5月)檢出率較高，冬季較低 。HCoV- 229E的流行高峰出現(xiàn)在2月，而其余月份的檢出率則要低得多。HCoV-NL63陽性率主要在夏季(7- 8月)和冬季(12月)檢出。HCoV-HKU1陽性率的高峰出現(xiàn)在1月至2月，不同月份的檢測率也存在差異。見表4。

2.3 冠狀病毒 HCoV核苷酸分析突變位置

我們在一些樣品中發(fā)現(xiàn)了核苷酸突變。N基因型的OC43冠狀病毒中有6個在N基因的25,059- 25,112核苷酸位置(參考菌株的Genbank登錄號：KF923904.1)中共有11個堿基的取代。發(fā)現(xiàn)基因型B的8種HKU1冠狀病毒中有6種在基因組的核苷酸位置24,465處有額外的插入，導致在Spike的氨基酸510位中有另外的氨基酸“蘇氨酸”插入(Genbank登錄號為DQ415911.1)。見表5。

表3 兒童呼吸道感染病毒類型的分布 例(%)

表4 兒童呼吸道感染的HCoV及其亞類月份的分布

表5 基因型N蛋白氨基酸位點突變分析

3 討 論

近年來，病毒研究的不斷進步和發(fā)展, 發(fā)現(xiàn)致呼吸道疾病的病毒種類越來越多,需要用病原診斷作為治療依據, 來指導呼吸系統(tǒng)感染性疾病的藥物選擇, 防止病毒對其他重要臟器的損害，合理用藥, 為避免濫用抗生素提供重要依據，具有重要的臨床意義。冠狀病毒(CoV)主要指人冠狀病毒(HCoV)是已知自然界中最長序列RNA病毒，能夠引起人類和動物呼吸道、消化道和神經系統(tǒng)感染。20世紀60年代發(fā)現(xiàn)的HCoV-OC43和HCoV- 229E多引起普通感冒，而SARS-CoV 及MERS-CoV的暴發(fā)流行也引起人們對HCoV- OC43，229E，NL63和HKU1的再次關注。HCoV感染可見于成人、小年齡兒童及新生兒。HCoV- OC43，229E，NL63和HKU1臨床多表現(xiàn)為亞臨床感染和輕度呼吸道感染，但在兒童、老年人、免疫功能抑制等人群中可致重癥呼吸道感染。研究表明在呼吸道感染的住院患兒中這4 種HCoV- OC43，229E，NL63和HKU1呈全年散發(fā)，流行季節(jié)不明顯。國內外研究顯示，在下呼吸道感染的住院患兒中HCoV的檢出率較低，占5.5%～7.9%，本研究中HCoV的檢出率也較低為11.14%。各種常見病毒的發(fā)病率，流感病毒A(IVA)111例(18.20%)、流感病毒B(IVB)61例(10.00%)、副流感病毒Ⅰ(PIVⅠ)42例(6.89%)、副流感病毒Ⅱ(PIVⅡ)34例(5.57%)、副流感病毒Ⅲ(PIVⅢ)77例(12.62%)、呼吸道合胞病毒(RSV)135例(22.14%)、腺病毒(ADV)82例(13.45%)，冠狀病毒(HCoV-OC43)68例(11.14%)。呼吸道感染多為流感病毒(A+B)和副流感病毒(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)共325例(53.28%)，其次是合胞病毒感染135例(22.14%)，腺病毒(ADV) 82例(13.45%)，冠狀病毒感染最低68例(11.14%)。

在SARS冠狀病毒爆發(fā)之前，冠狀病毒被認為會引起人類輕度，自限性呼吸道感染[12]。但是SARS-CoV和MERS-CoV的出現(xiàn)改變了人們的認識。 SARS-CoV的高致病性引起了對該病毒家族的新的關注，對SARS-和MERS-CoV起源的進一步研究表明冠狀病毒變異的可能性以及從動物宿主到人類的傳播[13- 14]。因此，對人以及動物冠狀病毒的監(jiān)測對于HCoV變異研究和感染控制非常必要且重要[15]。然而，據我們所知，從化地區(qū)的HCoVs分子流行病學報道非常有限，關于HCoV的變異報告很少。因此，在這項研究中，我們調查了從化地區(qū)兒童急性呼吸道感染癥狀的HCoV的分子流行病學特征，并對HCoV最普遍的種OC43的N基因進行了基因型分析，并觀察到新型OC43基因型N的流行情況。

我們在2017年1月—2019年6月，收集了610例急性呼吸道感染癥狀患者的咽喉和鼻拭子，檢測冠狀病毒和其他7種常見呼吸道病毒，RT-PCR方法用于HCoV檢測，以提高靈敏度并避免交叉污染和假陽性。與使用傳統(tǒng)PCR進行HCoV篩查相比，RT- PCR方法靈敏度更高可能有助于HCoV的檢出率更高，并且可能是在HCoV監(jiān)測中更好的方法。但是，由于HCoV的檢出率在不同的地區(qū)和國家中有所不同，所以檢出率不同的另一個原因也可能在于區(qū)域分布。我們共檢測到4種HCoV物種，包括HCoV- 229E，OC43，NL63和HKU1，未檢測到SARS-CoV和MERS-CoV，說明從化地區(qū)高致病性SARS-CoV和MERS-CoV沒有傳播到本地。在本地流行的HCoV中，最常見的是OC43，其次是229E和NL63，而HKU1的檢出率最低。

我們發(fā)現(xiàn)從月度分布HCoV主要是在冬季和春季流行，但不同物種之間存在差異。HCoV-OC43全年均可檢出，春季(4月和5月)檢出率較高，冬季較低。HCoV- 229E的流行高峰出現(xiàn)在2月，而其余月份的檢出率則要低得多。HCoV-NL63陽性率主要在夏季(7～8月)和冬季(12月)檢出。HCoV-HKU1陽性率的高峰出現(xiàn)在1月至2月，不同月份的檢測率也存在差異。在已有的報道研究中可以發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，該研究有2年的數據[16]。因此，連續(xù)監(jiān)測的數據對于揭示HCoV流行病學的模式非常重要[17]。我們在一些樣品中發(fā)現(xiàn)了核苷酸突變。N基因型的OC43冠狀病毒中有6個在N基因的25,059- 25,112核苷酸位置中共有11個堿基的取代。發(fā)現(xiàn)基因型B的8種HKU1冠狀病毒中有6種在基因組的核苷酸位置24,465處有額外的插入，導致在Spike的氨基酸510位中有另外的氨基酸“蘇氨酸”插入。該地區(qū)冠狀病毒HCoV- 0C43具有很大的臨床多樣性，與國內已發(fā)表的菌株HCoV- 0C43相比具有很高的同源性，同源性達97%～100%。

綜上所述，我們的結果表明，冠狀病毒OC43的檢出率與以前的報道相符，未發(fā)現(xiàn)新的傳染性冠狀病毒，冠狀病毒的流行趨勢穩(wěn)定，所有感染者均表現(xiàn)出輕到中度的呼吸道感染癥狀。HCoV-OC43春季(4月和5月)檢出率較高，冬季較低。由于本研究時間較短，陽性病例數較少，因此，需積累更多的資料，更好地了解其在兒童急性呼吸道感染中的作用。