孫曼曼， 高 雄， 方求武， 嚴(yán) 豪， 劉秀霞， 楊艷坤， 白仲虎

(1. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室; 2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 3. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 無錫 214122)

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性工業(yè)微生物，廣泛用于一些有機(jī)酸的合成[1]。因具有無內(nèi)毒素、抗逆性強(qiáng)、蛋白酶水平較低等優(yōu)勢，近年來谷氨酸棒桿菌也正逐漸被開發(fā)用于外源重組蛋白的表達(dá)[2]。

目前能夠用于谷氨酸棒桿菌重組蛋白表達(dá)的載體較少，常用的有pXMJ19、pEC-XK99E等載體，這些載體大部分仍是基于經(jīng)典的大腸桿菌Ptac或者Ptrc啟動(dòng)子來表達(dá)外源蛋白。盡管近年來也有一些內(nèi)源啟動(dòng)子以及合成啟動(dòng)子的篩選及應(yīng)用研究，但總體來看強(qiáng)度高于Ptac啟動(dòng)子的很少，并且基本也都是非誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。一些內(nèi)源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如對數(shù)末期自誘導(dǎo)的Pcg3141以及碳代謝誘導(dǎo)的PmalE1和Pgit1等[3-4]，綜合本底控制、表達(dá)強(qiáng)度以及誘導(dǎo)幅度等方面來看往往無法有效替代Ptac啟動(dòng)子。為進(jìn)一步提高Ptac啟動(dòng)子在谷氨酸棒桿菌中的表達(dá)能力，通過對Ptac啟動(dòng)子進(jìn)行突變，得到了更強(qiáng)的PtacM啟動(dòng)子[5-6]。而本研究選擇對Ptac啟動(dòng)子的5′末端非翻譯區(qū)進(jìn)行改造，在出發(fā)載體pXMJ19的lacO之后、多克隆位點(diǎn)(Multiple cloning site, MCS)前加入了一段谷氨酸棒桿菌的內(nèi)源雙順反子結(jié)構(gòu)，使得Ptac啟動(dòng)子能夠以雙順反子(Bicistronic)模式表達(dá)。改造后的增強(qiáng)型表達(dá)載體命名為pSM19。

干擾素(Interferon, IFN)是動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有廣譜抗病毒活性的細(xì)胞因子，主要分為Ⅰ型、Ⅱ型和近年來新發(fā)現(xiàn)的Ⅲ型。Ⅰ型干擾素主要包括IFN-α、IFN-β、IFN-ε和IFN-δ等。其中IFN-α是目前所知抗病毒活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子，在細(xì)胞中扮演著“清道夫”的角色，牛α-干擾素(BoIFN-α)對牛鼻氣管炎病毒、牛腹瀉病毒、口蹄疫病毒等在內(nèi)的多種病毒的復(fù)制起抑制作用[7]。

BoIFN-α在巴斯德畢赤酵母、昆蟲細(xì)胞、大腸桿菌中都已有表達(dá)的先例，但總的來說真核系統(tǒng)產(chǎn)量較低、大腸桿菌包涵體表達(dá)需要復(fù)性以及內(nèi)毒素等問題的存在使其研制始終停留在實(shí)驗(yàn)室階段[8-10]。對于在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中折疊困難的蛋白，通常會(huì)利用助溶標(biāo)簽、分子伴侶共表達(dá)或改變培養(yǎng)條件等手段提高可溶性蛋白比例。蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)降低培養(yǎng)溫度有助于誘導(dǎo)分子伴侶的產(chǎn)生從而幫助重組蛋白折疊。張弦等[10]利用pCold Ⅱ冷誘導(dǎo)系統(tǒng)在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了BoIFN-α的部分可溶性表達(dá)，誘導(dǎo)溫度為15 ℃，純化后折算產(chǎn)量為36 mg/L菌液。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647(CorynebacteriumglutamicumCGMCC1.15647)、大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pXMJ19，含有EGFP片段的質(zhì)粒pMD19-EGFP[11]，水皰性口炎病毒(VSV)由本實(shí)驗(yàn)室保藏。質(zhì)粒pSM19，pSM19-EGFP，pXMJ19-EGFP，pSM19-BoIFN-α在本研究中構(gòu)建。所用到的引物見表1，引物、BoIFN-α基因(GenBank: EU276064.1)的合成以及測序工作均由蘇州金唯智公司完成。

表1 本研究所用的引物

1.1.2 酶和試劑

所有限制性內(nèi)切酶均購自Thermo Fisher Scientific；Q5超保真DNA聚合酶購自New England Biolabs；2×EsTaqMasterMix(Dye)購自康為世紀(jì)公司；DNA高效連接液、末端轉(zhuǎn)移酶、總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑購自TaKaRa公司；同源重組酶購自諾唯贊公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒及膠回收試劑盒等購自Axygen公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)條件

大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)。如無特殊說明，谷氨酸棒桿菌使用LBB(LB+1%腦心浸出液)培養(yǎng)基在100 mL 搖瓶中培養(yǎng)，裝液量10 mL，接種量2%，培養(yǎng)溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min。表達(dá)BoIFN-α的谷氨酸棒桿菌分別在16 ℃和30 ℃培養(yǎng)，其它條件同上。

抗生素使用氯霉素，終濃度在大腸桿菌中為30 mg/L，在谷氨酸棒桿菌中為20 mg/L。IPTG終濃度為1 mmol/L，接種4 h后添加。

1.2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

為得到增強(qiáng)型表達(dá)載體pSM19，首先用引物P1/P2對谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647基因組擴(kuò)增。隨后將擴(kuò)增片段與HindⅢ內(nèi)切酶線性化過的pXMJ19質(zhì)粒利用同源重組酶重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。過夜培養(yǎng)長出單克隆后，挑單克隆做菌落PCR驗(yàn)證，正確后送基因測序。

用內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ線性化質(zhì)粒pSM19。利用引物P3/P4對質(zhì)粒pMD19-EGFP擴(kuò)增，所得EGFP片段與線性化后的pSM19重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)挑單克隆測序驗(yàn)證得到質(zhì)粒pSM19-EGFP。

利用引物P4/P5對質(zhì)粒pMD19-EGFP擴(kuò)增，所得EGFP片段以及質(zhì)粒pXMJ19分別用HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)挑單克隆測序驗(yàn)證得到質(zhì)粒pXMJ19-EGFP。

質(zhì)粒pSM19-BoIFN-α由蘇州金唯智公司合成密碼子優(yōu)化的BoIFN-αDNA片段后(C端添加6×組氨酸標(biāo)簽)，通過Hind III/EcoR I亞克隆到pSM19中得到。

1.2.3 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白強(qiáng)度的測定

將待測的谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)物用PBS緩沖液洗滌2次，重懸并將OD600調(diào)至0.5左右，使用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為507 nm。

1.2.4 RNA提取及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的鑒定

4 ℃離心收集菌體，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2遍，盡量吸去離心后上清。用1 mL Trizol試劑將菌體重懸入含有約1 cm3玻璃珠的破碎管中，并通過Precellys 24高通量細(xì)胞破碎儀破碎6次，每次30 s，間隔期間用液氮迅速冷卻。破碎后12 000 r/min 4 ℃離心10 min，吸取上清轉(zhuǎn)移至無RNA酶污染的1.5 mL EP管中。隨后步驟依照TaKaRa RNAiso Plus(#9108)說明書進(jìn)行RNA抽提。

提取質(zhì)量較好，無DNA污染的谷氨酸棒桿菌總RNA，利用cDNA末端加多聚脫氧核糖核苷酸尾法的5′RACE實(shí)驗(yàn)進(jìn)行基因NCgl2826的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcription Start Point, TSP)鑒定[12]。反轉(zhuǎn)錄引物為P6，PCR鑒定引物為P7和P8。

1.2.5 BoIFN-α干擾素的表達(dá)、純化

將經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的BoIFN-α基因直接合成連接至pSM19載體，電轉(zhuǎn)至谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647中。挑單克隆過夜活化后1∶50轉(zhuǎn)接至新鮮的LBB培養(yǎng)基中。30 ℃培養(yǎng)4 h后開始誘導(dǎo)，IPTG終濃度為1 mmol/L。

利用Applicon 5 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)。將BoIFN-α表達(dá)菌株過夜活化后以1∶50轉(zhuǎn)接至100 mL LBB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，隨后將100 mL二級(jí)種子全部接至1.9 L A medium(添加4%葡萄糖)培養(yǎng)基[13]。在反應(yīng)器中以30 ℃、pH 7、溶氧30%、轉(zhuǎn)速400～1000 r/min的條件培養(yǎng)4 h后開始降溫，待溫度穩(wěn)定至16 ℃后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。

離心收集100 mL發(fā)酵液，PBS洗滌1遍，充分懸浮于40 mL裂解緩沖液中。超聲破碎后使用AKTA蛋白純化系統(tǒng)過鎳柱純化。收集純化后的蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。

1.2.6 BoIFN-α干擾素活性的初步測定

采用MDBK-VSV(牛腎細(xì)胞-水泡性口炎病毒)系統(tǒng)測定純化的BoIFN-α生物活性。1個(gè)活性單位(U)定義為抑制50%細(xì)胞病變(CPE)的最高稀釋度。觀察記錄CPE，采用Reed-Muench法計(jì)算干擾素活性[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCgl2826 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的鑒定

本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中已經(jīng)證明了在谷氨酸棒桿菌中將部分內(nèi)源啟動(dòng)子以雙順反子形式表達(dá)后較單順反子形式更強(qiáng)[15]。相關(guān)表達(dá)元件結(jié)構(gòu)示意圖(圖1)顯示：核糖體在內(nèi)源啟動(dòng)子自身的5′端非翻譯區(qū)(5′ Untranslated region, 5′UTR)被募集并起始內(nèi)源基因翻譯一段小肽，隨后移動(dòng)到額外引入的保守Shine-Dalgarno序列(SD序列)內(nèi)部時(shí)識(shí)別終止密碼子TAA而脫離，并在這一SD序列的募集作用下從與TAA緊密相連的ATG處起始目的基因翻譯。這一結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)作用與核糖體的富集以及mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)[16]。

TSP: transcription start point; SD: Shine-Dalgarno sequence

圖1雙順反子表達(dá)元件結(jié)構(gòu)示意圖

Figure 1 Architecture diagram of bicistronic expression elements

同時(shí)，在內(nèi)源啟動(dòng)子的篩選、比較中，我們發(fā)現(xiàn)基因NCgl2826啟動(dòng)子雙順反子化表達(dá)EGFP時(shí)轉(zhuǎn)錄水平并沒有提高，而表達(dá)強(qiáng)度相比單順反子提高了約2倍[15]。由此推測該基因的雙順反子UTR元件可能具有獨(dú)立的提高翻譯效率的能力，從而與Ptac啟動(dòng)子融合后更好地促進(jìn)外源蛋白的表達(dá)。

為了規(guī)避內(nèi)源啟動(dòng)子序列對雙順反子UTR元件的干擾，我們首先對該基因的TSP進(jìn)行鑒定，以確定轉(zhuǎn)錄出mRNA的完整的5′UTR。如圖2所示，5′RACE-PCR擴(kuò)增后在約300 bp處有一個(gè)特異性條帶，測序比對后得知該條帶對應(yīng)的TSP位于ATG之前26 bp處。

2.2 增強(qiáng)型表達(dá)載體pSM19的構(gòu)建

出發(fā)載體pXMJ19是一個(gè)谷氨酸棒桿菌/大腸桿菌穿梭載體[17]，其Ptac啟動(dòng)子以及操縱子lacO之后沒有核糖體結(jié)合位點(diǎn)。為保留其Ptac啟動(dòng)子的IPTG誘導(dǎo)特性，我們選擇將NCgl2826的UTR-順反子元件加入到pXMJ19的lacO之后，MCS之前。

如圖3所示，利用引物擴(kuò)增基因組得到NCgl2826的5′UTR以及ATG之后59 bp的對應(yīng)DNA片段，引物在該片段5′末端引入一個(gè)XhoI酶切位點(diǎn)以方便后續(xù)酶切驗(yàn)證，在3′末端引入了一個(gè)含有保守SD序列的接頭(AAAGGAGGACAACTAATG)，使得前順反子的翻譯會(huì)在25個(gè)氨基酸后遇到終止密碼子而停止，脫落的核糖體隨即能在SD序列的作用下起始后順反子的翻譯。將該片段以同源重組的方式克隆到pXMJ19的MCS之前，得到了增強(qiáng)型表達(dá)載體pSM19。

M: TaKaRa DL2000 DNA marker; 1: 5′RACE-PCR amplification products; 2: Single primer amplification control of primer P7; 3: Single primer amplification control of primer P8

圖2NCgl28265′RACE鑒定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

Figure 2 TSP identification ofNCgl2826 by 5′ RACE

圖3 pSM19的構(gòu)建流程

2.3 EGFP表達(dá)對比

如圖3所示，由于雙順子UTR元件的引入，pSM19自身已經(jīng)會(huì)從MCS前的ATG處開始表達(dá)，因此用經(jīng)典的酶切連接方式加入目的基因CDS序列時(shí),最少會(huì)產(chǎn)生編碼兩個(gè)氨基酸的酶切位點(diǎn)冗余(由HindⅢ酶切位點(diǎn)編碼的兩個(gè)氨基酸)。為了體現(xiàn)比較的一致性，pSM19載體經(jīng)HindⅢ和EcoR I雙酶切后，利用5′端不含HindⅢ酶切位點(diǎn)的同源臂，將EGFP片段引入以消除5′端的HindⅢ酶切位點(diǎn)冗余，得到pSM19-EGFP。與pXMJ19-EGFP載體相比，二者的Ptac啟動(dòng)子、直接啟動(dòng)EGFP表達(dá)的SD序列以及CDS部分均完全相同。并且由于pSM19保留了乳糖操縱子lacO，因此理論上仍會(huì)受IPTG調(diào)控。

將兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌表達(dá)菌株中后，分別測定EGFP表達(dá)情況?？梢妏SM19本底(不添加IPTG)略高于原始載體pXMJ19，但在添加IPTG情況下，pSM19的EGFP表達(dá)量在24 h高出pXMJ19約99.5%(圖4)。

圖4 pXMJ19與pSM19 EGFP表達(dá)水平比較

2.4 牛α-干擾素的表達(dá)

谷氨酸棒桿菌密碼子優(yōu)化的BoIFN-α成熟蛋白基因序列經(jīng)公司合成后，直接通過Hind III/EcoR I亞克隆到pSM19中。將pSM19-boIFNα質(zhì)粒轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果(圖5)顯示，實(shí)驗(yàn)組相比對照，在約16 ku處有明顯的重組表達(dá)條帶，但30 ℃培養(yǎng)時(shí)，大部分都是包涵體表達(dá)，而16 ℃培養(yǎng)時(shí)，BoIFN-α大部分能夠以可溶形式表達(dá)。

圖5 SDS-PAGE檢測BoIFN-α的表達(dá)

2.5 牛α-干擾素的純化與活性測定

在5 L發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)，檢測不同時(shí)間點(diǎn)的重組蛋白表達(dá)情況，可見24 h后BoIFN-α基本不再有積累。發(fā)酵結(jié)束后離心收集100 mL菌體，破碎后上清過鎳柱得到初步純化后的重組BoIFN-α，其SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖6所示。利用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，估算重組牛α-干擾素的產(chǎn)量為68 mg/L。利用MDBK-VSV系統(tǒng)測定純化后重組BoIFN-α的活性為(1.35±0.23)×106U/mg。

圖6 5 L反應(yīng)器中不同時(shí)間BoIFN-α的表達(dá)情況(a)以及純化后BoIFN-α的SDS-PAGE分析(b)

3 討論與結(jié)論

本課題對谷氨酸棒桿菌的常用表達(dá)載體pXMJ19的5′-UTR部分進(jìn)行了改造，使得Ptac啟動(dòng)子在保留了IPTG誘導(dǎo)特性的同時(shí)又能得到顯著增強(qiáng)。改造載體pSM19的MCS與出發(fā)載體完全一致，基本能夠直接應(yīng)用后者的克隆和引物設(shè)計(jì)方式，為谷氨酸棒桿菌中重組蛋白的高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

本研究顯示出所使用的5′-UTR雙順反子元件或許能夠作為一種獨(dú)立的蛋白表達(dá)增強(qiáng)元件被開發(fā)，但其獨(dú)立性和通用性仍需從3個(gè)方面進(jìn)行考量：不同的5′-UTR雙順反子元件、待表達(dá)蛋白以及啟動(dòng)子從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前的替換。即不同基因的5′-UTR雙順反子元件是否具有不同幅度的增強(qiáng)功能，它們增強(qiáng)能力的高低趨勢是否又會(huì)因從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處替換不同的啟動(dòng)子，或者從MCS處替換不同CDS而發(fā)生變化。

本研究首次在食品級(jí)工業(yè)微生物谷氨酸棒桿菌中實(shí)現(xiàn)了BoIFN-α的部分可溶、且有較強(qiáng)抗病毒生物學(xué)活性的重組表達(dá)，純化后產(chǎn)量預(yù)估為68 mg/L菌液。然而，革蘭氏陽性菌的谷氨酸棒桿菌相比大腸桿菌較難破壁，若能進(jìn)行分泌性表達(dá)則更易于發(fā)酵后續(xù)的純化步驟，從而為重組BoIFN-α的研發(fā)和生產(chǎn)提供更好的解決方案。Tu等已在巴斯德畢赤酵母中對BoIFN-α進(jìn)行了分泌表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)純化后濃度為200 mg/L[8]。谷氨酸棒桿菌同樣具有很強(qiáng)的蛋白分泌能力，且發(fā)酵周期要比畢赤酵母等真核生物更短。因此，重組BoIFN-α在谷氨酸棒桿菌中的分泌表達(dá)是下一步需要解決的問題。