張遠莉， 龐延軍

(南京大學 生命科學學院， 南京 210093)

遺傳學是生命科學、醫(yī)學、農學等相關領域的核心課程，是一門理論與實踐相結合的課程，遺傳學實驗是遺傳學課程教學的重要組成部分[1-4]。遺傳學實驗教學不僅要完成傳統(tǒng)的以驗證性和示范性實驗為主的課程，還需要培養(yǎng)學生嚴謹?shù)目蒲兴季S，提高主觀能動性[5-8]。因此我們在遺傳學實驗的教學中緊密結合科學研究，設計一些綜合性實驗，將科研成果引入課堂，培養(yǎng)具有創(chuàng)造力的科研人才。

本次綜合性實驗選擇對植物抗病基因Pib的片段進行人工合成與進化，指導學生從不同的水稻品種中克隆出抗病基因的片段，利用現(xiàn)存的自然變異，采用DNA改組(DNA shuffling)技術進行重組，人工進化得到新的基因片段。DNA 改組是目前最常用的人工合成與進化基因的技術之一，它是由Stemmer于1994年首次提出并在美國Affymax研究所的實驗室取得成功[9-10]，也稱為有性PCR(sexual PCR)、分子育種(Molecular Breeding)。DNA改組主要包括以下幾步：1)模板準備。單個基因或一組同源基因為模板。2)酶切：用化學方法(如脫氧核糖核酸酶I：DNaseI酶切)或物理方法(如超聲破碎法)將基因切割成一系列隨機大小的小片段。3)無引物PCR。這些DNA小片段間具有一定同源性，可互為引物，在不加引物的情況下通過PCR法將小片段組裝成大片段。4)有引物PCR。以無引物PCR產物為模板，稀釋后，加入合適的引物將大片段相連，得到一個重組基因文庫。5)篩選和測序。將此基因文庫導入合適質粒，篩選、測序重組子基因。也可將得到的重組子基因，與初始的同源基因混合在一起，作為第二輪DNA改組的模板，重復上述步驟，直至得到所需的突變基因。DNA 改組技術是一項全新的體外人工進化模式，是迄今為止所建立的最有效的分子進化技術。

通過本次綜合實驗，可以讓學生了解分子遺傳學的基本操作，從分子水平揭示遺傳學的基本現(xiàn)象與規(guī)律，并通過綜合性、設計性實驗，培養(yǎng)學生初步獨立進行科學研究的能力和創(chuàng)新能力，為創(chuàng)新型人才培養(yǎng)提供平臺。

1 實驗方案

1.1 學生分組與實驗材料

每班學生約30人，每組4人左右。實驗儀器有微量移液器、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、離心機、搖床、培養(yǎng)箱、滅菌鍋等。實驗試劑：Taq酶、連接酶、PCR相關試劑購自大連寶生物公司；DNaseⅠ 購自Sigma公司；質粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。

實驗材料：提供30～40個水稻品種。每組同學合作完成本實驗的所有工作。

1.2 實驗方案安排

學生首先以提供的水稻品種為模板，PCR擴增得到基因片段(Pib基因)，連入T載體后進行測序，得到親本的基因序列。然后在教師和助教的指導下對測序出的序列進行分析，挑選合適的基因片段作為下一步人工進化的親本。

將各自選取的親本DNA，各取約2 μg混勻，加入DNaseⅠ 15 ℃消化30 min。消化反應結束后，首先80 ℃變性5 min，滅活DNaseⅠ。然后用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，在紫外燈下割取50～100 bp的片段，進行DNA片段的回收。

在PCR反應體系中加入DNaseⅠ消化產物，在不加入引物的條件下進行PCR反應，讓斷裂的片段之間互為引物和模板，進行配對和延伸。

無引物PCR反應結束以后，需要特異性的擴增出重組的目的片段，將無引物PCR產物純化后，稀釋1000倍作為模板進行有引物PCR反應(引物序列與產物長度如表1所示)。有引物PCR反應結束后將得到與親本DNA條帶一樣大小的目的條帶。

對PCR產物進行純化，與T載體連接，提取質粒，進行序列的測定和實驗結果分析。

表1 實驗中引物序列與產物長度

2 實驗過程

2.1 實驗親本選擇

要合成某種基因，首先要了解該基因的遺傳資源變異狀況。因此，對用于合成目標基因的材料首先進行品種間的遺傳多態(tài)性分析(MEGA軟件：Molecular evolutionary genetics analysis)。給學生提供30～40個材料，讓學生分別對這些基因進行克隆和測序；匯總后通過對序列的分析，挑選合適的基因作為下一步人工進化的親本。指導學生根據(jù)不同實驗目的來選擇人工進化的親本，選擇的親本數(shù)量和品種都由自己決定，學習自主選擇和設計實驗。表2是其中一組學生選擇的用于基因重組的7個親本，它們的平均核苷酸差異度(Pi，Nucleotide diversity)是0.096。

表2 7個親本基因的核苷酸差異度

2.2 酶切與重組基因文庫合成

DNA 改組是一項操作性很強的技術，這種技術受很多因素的影響，包括DNaseⅠ酶切片段大小，親本DNA序列的差異度和有性PCR，這些因素都將影響DNA改組的結果。其中親本DNA片段的酶切效果影響最大，因為親本DNA酶切的好壞將直接影響改組的效果，酶切后的片段要求均一性比較好，這樣可以避免某一親本片段的過于密集。片段大小的選擇也十分重要，一般情況下它與改組的基因片段大小有密切的關系。改組的片段長度小于1 kb，則適宜選擇100 bp以下的片段，1～2 kb則適合選擇100～200 bp的片段，片段的大小將直接影響重組體的規(guī)模和序列差異的大小。若選擇太小的片段，則重聚比較困難；選擇太大的片段，則重組的效果較差。在實驗中，我們的目的片段是1500 bp左右。綜合以上考慮，學生們最后選擇了100 bp左右的片段。在具體實驗中，學生們體驗了自己設計和優(yōu)化實驗的過程，有些實驗條件需要自己多次摸索才能獲得比較理想的結果(圖1)。雖然實驗過程繁瑣，但是學生們的興趣很大，都希望通過自己的努力獲得實驗的成功。

M：DL2000 Marker

圖1DNA改組步驟

Figure 1 Procedure of DNA shuffling

2.3 重組基因測序結果分析

重組后的基因片段純化后，與Promega T載體進行連接，轉化以后得到了1000多個重組克隆，挑選部分重組克隆進行序列測定。然后指導學生利用生物信息學軟件(MEGA軟件：Molecular evolutionary genetics analysis)對序列進行分析，部分結果如圖2和圖3所示。測定的所有序列之中沒有任何兩個一樣的序列，說明重組后的群體較大，變異十分豐富，也間接地說明了DNA改組后親本序列的交換和重組比較頻繁。核苷酸比較分析發(fā)現(xiàn)，變異大多數(shù)來源于親本DNA之間的重組和交換，而且交換的頻率較大，也有小部分變異來源于隨機突變，如圖2中紅色圓圈標注部分。重組后的平均核苷酸差異度達到了9.3%，與親本基因間的核苷酸差異度基本一致。把重組后的序列與7個親本序列進行進化樹構建(鄰接法NJ：Neighbor-Joining)，顯示重組后的序列分布在不同的分枝上(圖3)，但還是可以看出基本是平均分布在親本序列的周圍，說明這些序列的變異主要還是來自于親本序列片段間的交換，隨機突變的貢獻不是很大。

圖2 重組基因的核苷酸序列比對

圖3 重組基因的系統(tǒng)進化樹Figure 3 Phylogenetic tree of DNA shuffling genes

3 總結

在高等教育階段，教學和科研是相輔相成的。本實驗中，指導學生利用基因的DNA 改組技術，進行基因的人工進化，學生分組完成測序得到的200個重組體與親本DNA序列完全不同，得到了自然界中不存在的序列，觀察和了解基因的人工進化。傳統(tǒng)的遺傳學實驗中，多以驗證性實驗為主，以掌握實驗方法為出發(fā)點。本實驗的不同之處是一個綜合性實驗，具有一定生物學意義，通過實驗引導學生學習“提出問題、分析問題和解決問題”的方法，較好地激發(fā)了學生的學習興趣。近兩年的遺傳學實驗課程教學評分比以前都有所提高，實驗后學生提交的實驗感想也提出了對此類綜合性實驗比較感興趣。

DNA改組一般是針對某個特定的基因，其主要的優(yōu)勢在于時間短，見效快。1994年，Stemmer用DNA改組技術將細菌對抗生素的抗性提高了32 000倍[10]。通過本實驗的學習，學生在分子水平上了解生物的遺傳和變異機制，掌握了如PCR、DNA提取、細菌的遺傳轉化等分子遺傳學的相關技術。這樣一組綜合實驗，歷時一個月左右，學生不僅掌握了一些分子遺傳學的實驗方法，而且學習了運用生物信息學分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，加強了對理論知識的理解，提高了運用知識的綜合能力，同時也為培養(yǎng)學生的科研思維能力奠定了基礎。

總之，學生科研思維和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)是現(xiàn)代高等教育的重要方向，我們將不斷調整實驗教學方案，構建完善的實驗教學體系，培養(yǎng)高素質的科研人才。