高歡歡, 覃冬云, 代曉彥, 劉 潔, 于 毅,*

(1. 山東省葡萄研究院, 濟南 250100; 2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 濟南 250100)

自然界的昆蟲在種群間競爭過程中，同類昆蟲會進化分享不同的生態(tài)位，以至于有些昆蟲種類為了生存而必須適應(yīng)并非最佳的生態(tài)位(Poisotetal., 2011)。斑翅果蠅Drosophilasuzukii隸屬雙翅目(Diptera)果蠅科(Drosophilidae)果蠅屬Drosophila，具有與其他果蠅生態(tài)位分離的特點。絕大部分果蠅喜愛于腐爛果實上產(chǎn)卵，腐爛果實中滋生的大量微生物富含豐富的蛋白質(zhì)，為果蠅幼蟲的發(fā)育提供了重要的營養(yǎng)(Becheretal., 2012)。而斑翅果蠅則利用其堅硬鐮刀狀的產(chǎn)卵器，直接刺破果皮將卵產(chǎn)于剛剛成熟的果皮下，卵孵化后以幼蟲蛀食為害，果實逐漸軟化以致變褐腐爛(Goodhueetal., 2011; Milanetal., 2012)。新鮮水果中糖類和其他碳水化合物較多，蛋白質(zhì)和氨基酸則相對缺乏，因此斑翅果蠅作為一種典型的生態(tài)位轉(zhuǎn)變的物種(Atallahetal., 2014)，需要適應(yīng)營養(yǎng)上的劣勢。

大量研究證明，昆蟲腸道中的共生菌可參與寄主的能量與代謝的平衡，為宿主昆蟲的生長發(fā)育和繁殖提供所需要的營養(yǎng)成分，彌補昆蟲自身代謝的缺陷(Douglas, 2009)。例如，橄欖果蠅Bactroceraoleae為適應(yīng)蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量極度不平衡的橄欖，在消化系統(tǒng)增生了一種囊狀結(jié)構(gòu)，在食物中蛋白質(zhì)含量較少時，可將儲存的共生細菌釋放至食道和中腸，通過相關(guān)代謝途徑補充其發(fā)育繁殖所需要的游離氨基酸和蛋白質(zhì)(Ben-Yosefetal., 2010)。黑腹果蠅成蟲腸道微生物中的醋酸菌可參與果蠅體內(nèi)乙醇、醋酸的代謝，產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物有利于果蠅的生長發(fā)育(Ryuetal., 2008; Shinetal., 2011; Fischeretal., 2017)。由此可知，共生微生物是通過調(diào)節(jié)寄主的代謝通路以及由此產(chǎn)生的代謝物來影響寄主的生長發(fā)育，但未見腸道細菌參與斑翅果蠅代謝過程的相關(guān)報道。

斑翅果蠅與其他果蠅的生態(tài)位和取食條件均不同，腸道中的微生物多樣性也會發(fā)生相應(yīng)變化。經(jīng)過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和鑒定，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段的斑翅果蠅腸道內(nèi)比較穩(wěn)定的細菌種類為弗氏檸檬酸桿菌Citrobacterfreundii、產(chǎn)酸克雷伯菌Klebsiellaoxytoca、金黃桿菌屬Chryseobacteriumsp.、紡錘形賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillusfusiformis和醋酸菌Acetobacterthailandicus(高歡歡等, 2019)。斑翅果蠅取食后的葡萄中也發(fā)現(xiàn)了弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌(高歡歡等, 2017)。另外，弗氏檸檬酸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌在多種昆蟲的腸道中均屬于豐富度相對較高的物種。例如，Yong等(2019)研究表明產(chǎn)酸克雷伯氏菌在南亞3個瓜實蠅Zeugodacuscucurbitae地理種群腸道中的相對豐富度均在10%以上;在瓜實蠅中腸中，克雷伯氏菌和檸檬酸桿菌均占較高比例，分別為19.2%和7.7% (Hadapadetal., 2016)。蔥地種蠅Deliaantiqua、西方蜜蜂Apismellifera、橘小實蠅Bactroceradorsalis等昆蟲中也含有大量的檸檬酸桿菌和克雷伯氏菌(Guoetal., 2017; Fasasi, 2018; Zhouetal., 2019)，說明這兩種細菌與昆蟲之間的關(guān)系極為密切，但弗氏檸檬酸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌與斑翅果蠅之間的關(guān)系未見相關(guān)報道。

因此，本研究選擇斑翅果蠅與葡萄中相互傳遞和共生的弗氏檸檬酸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯菌飼喂斑翅果蠅，觀察斑翅果蠅生長發(fā)育及幼蟲體內(nèi)代謝物含量和抗氧化酶活性的變化，從而為明確兩種菌參與斑翅果蠅代謝過程的機制提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和斑翅果蠅

弗氏檸檬酸桿菌C.freundi和產(chǎn)酸克雷伯氏菌K.oxytoca菌株為山東省葡萄研究院自存的菌株。斑翅果蠅來源于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所的實驗室種群。

1.2 正常飼養(yǎng)的斑翅果蠅品系的建立

斑翅果蠅實驗室種群飼養(yǎng)于溫度為25±0.5℃、相對濕度為70%±0.5%、光周期為16L∶8D的人工氣候室中。飼喂以香蕉、蘋果、玉米粉、蔗糖、酵母、防腐劑主要成分的人工飼料，此為正常飼養(yǎng)的斑翅果蠅品系。

1.3 無菌斑翅果蠅品系的建立

參考前人的方法(Brummeletal., 2004; 劉威等, 2019)并進行了改進，收集產(chǎn)下后6-8 h內(nèi)的斑翅果蠅卵，無菌水清洗卵表面后，用3.0%的次氯酸鈉消毒1 min, 70%乙醇消毒2次, 1 min/次, 0.1% Triton X-100的磷酸緩沖液(pH 7)清洗1次，用無菌水再次清洗后，將卵轉(zhuǎn)移到滅菌后的果蠅人工飼料上，放置于無菌的塑料培養(yǎng)瓶(直徑6 cm，高8 cm)中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為25±1℃，相對濕度為60%±2%，光周期為16L∶8D，建立無菌斑翅果蠅體系。

收集無菌斑翅果蠅體系的卵、幼蟲研磨，稀釋10倍后，取200 μL在NA培養(yǎng)基品平板上涂板，在相同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察無菌落生長便可判斷無菌果蠅品系創(chuàng)建成功。

1.4 兩種細菌單一感染斑翅果蠅品系的建立

取弗氏檸檬酸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌單菌落在LB培養(yǎng)基中震蕩搖菌過夜，將滅菌后的果蠅塊狀飼料在菌液中浸泡5 min，然后將1.2節(jié)無菌果蠅品系與菌液浸泡過的人工飼料放置于無菌的塑料培養(yǎng)瓶(直徑6 cm，高8 cm)中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度、濕度、光周期條件同1.2節(jié)，建立兩種細菌單一感染果蠅品系。驗證方法同1.2節(jié)，觀察是否只有單一菌種生長，并將菌落進行16S rDNA鑒定，其具體方法如下：

挑取單菌落，在液體培養(yǎng)基中過夜搖勻，以菌液作為模板進行 PCR 擴增。PCR反應(yīng)體系: DNA 模板 2 μL, 2×Taq Plus PCR Master Mix 12.5 μL, 濃度為10 μmol/L上下游引物各 1 μL, 加入ddH2O補充至25 μL。PCR反應(yīng)程序: 94℃預(yù)熱3 min; 94℃熱變性30 s, 52℃退火 30 s, 72℃延伸1 min, 共 30 個循環(huán); 72℃反應(yīng)后延伸5 min。引物序列為16S rDNA-27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S rDNA-1492R: 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。

將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收后送山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院測序中心進行雙向測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST 分析，如確定為弗氏檸檬酸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌，則證明兩者的單一感染果蠅品系建立成功。

1.5 斑翅果蠅生長發(fā)育指標檢測

分別從斑翅果蠅無菌品系、弗氏檸檬酸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌單一感染品系以及正常飼料飼養(yǎng)的品系中挑取斑翅果蠅6-8 h的卵50粒，放置于無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部鋪有一層無菌瓊脂(3%)，便于保濕和觀察。然后放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 h觀察一次，直至無幼蟲孵化為止，重復(fù)3次，統(tǒng)計不同斑翅果蠅品系中孵化出的幼蟲數(shù)量，計算卵孵化率。將上述4種果蠅品系中孵化的幼蟲分別轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的培養(yǎng)瓶中，待其化蛹，統(tǒng)計化蛹的數(shù)量，計算化蛹率。

另外在上述4種果蠅品系中挑取孵化5 d的3齡幼蟲，每10頭幼蟲為一個重復(fù)，稱量總重，計算每頭幼蟲的體重，重復(fù)3次。

1.6 3齡幼蟲體內(nèi)主要代謝物含量的測定

在4種斑翅果蠅品系中各挑取大約1.0 g 3齡幼蟲，在冰上研磨，根據(jù)試劑盒(蛋白質(zhì)含量測定試劑盒: BCAP-1-W; 氨基酸含量測定試劑盒: AA-1-W; 糖原含量測定試劑盒: TY-1-Y; 游離脂肪酸含量測定試劑盒：FFA-1-W)，加入相應(yīng)體積的提取液，經(jīng)過離心、加入反應(yīng)液、溫浴等步驟后用酶標儀(EMax Plus, Molecular Devices)進行測定，波長分別為562, 570, 620和715 nm，每個樣品測定 3 次作為技術(shù)重復(fù)，取其平均值為每個生物學(xué)重復(fù)的值，根據(jù)試劑盒中的公式計算物質(zhì)含量。每個斑翅果蠅品系設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，分別測定蛋白質(zhì)、氨基酸、糖原和游離脂肪酸含量。

1.7 3齡幼蟲體內(nèi)抗氧化酶的活力測定

在4種斑翅果蠅品系中各挑取大約1.0 g 3齡幼蟲，在冰上研磨，根據(jù)試劑盒(SOD含量測定試劑盒: BCAP-1-W; POD含量測定試劑盒: AA-1-W; CAT測定試劑盒:TY-1-Y)，加入相應(yīng)體積的提取液，經(jīng)過離心、加入反應(yīng)液、溫浴等步驟后用酶標儀(EMax Plus, Molecular Devices)進行測定，波長分別為560, 470和240 nm，每個樣品測定 3 次作為技術(shù)重復(fù)，取其平均值為每個生物學(xué)重復(fù)的值，根據(jù)試劑盒中的公式計算酶的活力。每個斑翅果蠅品系設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。分別測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活力。

1.8 數(shù)據(jù)分析

4種斑翅果蠅品系的卵孵化率、化蛹率、幼蟲體重、各代謝物的含量以及抗氧化酶的活力均進行單因素方差分析，采用S-N-K法檢驗區(qū)分平均值，顯著水平為0.05。數(shù)據(jù)分析所用的軟件為 SPSS20.0。

2 結(jié)果

2.1 兩種腸道細菌對斑翅果蠅生長發(fā)育的影響

正常飼養(yǎng)條件下，斑翅果蠅的卵孵化率為94.5%±0.9%，顯著高于弗氏檸檬酸桿菌感染品系、產(chǎn)酸克雷伯氏菌感染品系和無菌斑翅果蠅品系的(P<0.05)，且無菌品系的卵孵化率最低，但仍有65.9%±3.1%的果蠅卵可以正常孵化(F=30.75,df=2,P<0.01)(圖1: A)。

正常飼養(yǎng)斑翅果蠅品系與弗氏檸檬酸桿菌感染斑翅果蠅品系3齡幼蟲體重?zé)o顯著差異(P>0.05)(圖1: B)，分別為1.55±0.05和1.49±0.06 mg/頭，但顯著高于產(chǎn)酸克雷伯氏菌感染的斑翅果蠅品系和無菌品系的(P<0.05);與卵孵化率趨勢相似，無菌品系的幼蟲體重最低，每頭僅有0.68±0.04 mg(F=55.08,df=2,P<0.01)。

4種果蠅品系的化蛹率差異顯著(F=90.35,df=2,P<0.01)，正常品系的化蛹率為77.5%±2.8%，顯著高于其他3個品系的(P<0.05)(圖1: C)。

圖1 4個斑翅果蠅品系卵孵化率(A)、3齡幼蟲體重(B)和化蛹率(C)Fig. 1 Egg hatching rate (A), body weight of the 3rd instar larvae (B) and pupation rate (C) of four Drosophila suzukii strainsSterile: 無菌斑翅果蠅品系Sterile D. suzukii strain; CF: 弗氏檸檬酸桿菌感染的斑翅果蠅品系Citrobacter freundi infected D. suzukii strain; KO: 產(chǎn)酸克雷伯氏菌感染的斑翅果蠅品系Klebsiella oxytoca infected D. suzukii strain; Normal: 正常條件飼養(yǎng)的斑翅果蠅品系D. suzukii strains fed in normal conditions. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上不同字母代表4種果蠅品系間差異顯著(P<0.05, One-way ANOVA, S-N-K法)。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant differences among four D. suzukii strains (P<0.05, One-way ANOVA, S-N-K test). 下同The same below．

2.2 兩種腸道細菌對斑翅果蠅幼蟲蛋白和氨基酸含量的影響

4種品系的3齡幼蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸的含量差異顯著(蛋白質(zhì):F=16.87,df=2,P<0.01; 氨基酸:F=3.77,df=2,P=0.06)。正常飼養(yǎng)的斑翅果蠅品系3齡幼蟲體內(nèi)蛋白含量(4.04±0.24 mg/g FW)顯著高于其他3種果蠅品系的，其次為產(chǎn)酸克雷伯氏菌感染的斑翅果蠅品系的(3.47±0.02 mg/g FW)，蛋白質(zhì)含量較低的為無菌品系和弗氏檸檬酸桿菌感染品系，兩者之間差異并不顯著(P>0.05)(圖2: A)。無菌品系3齡幼蟲體內(nèi)氨基酸含量(236.89±6.22 mg/g FW)與正常品系之間差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于弗氏檸檬酸桿菌感染斑翅果蠅品系(181.54±4.12 mg/g FW)和產(chǎn)酸克雷伯氏菌感染的斑翅果蠅品系的(199.18±4.40 mg/g FW)(F=3.77,df=2,P=0.06)(圖2: B)。

圖2 4個斑翅果蠅品系3齡幼蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)(A)和氨基酸(B)含量Fig. 2 Contents of protein (A) and amino acids (B) in the 3rd instar larvae of four Drosophila suzukii strains

2.3 兩種腸道細菌對斑翅果蠅幼蟲糖原和游離脂肪酸含量的影響

由圖3可知，不同品系的3齡幼蟲體內(nèi)的糖原和游離脂肪酸含量存在顯著差異(糖原:F=15.16,df=2,P<0.01; 游離脂肪酸:F=12.33,df=2,P<0.01)。無菌品系3齡幼蟲體內(nèi)糖原的含量(10.57±0.21 mg/g FW)與正常品系之間并無顯著差異(P>0.05)，但添加了細菌后，弗氏檸檬酸桿菌感染的斑翅果蠅品系(8.88±0.51 mg/g FW)和產(chǎn)酸克雷伯氏菌感染的斑翅果蠅品系的糖原含量(8.04±0.29 mg/g FW)顯著低于無菌品系和正常品系的(P<0.05)(圖3: A)。 弗氏檸檬酸桿菌感染的斑翅果蠅品系3齡幼蟲體內(nèi)游離脂肪酸含量為529.02±7.01 mg/g FW，顯著低于無菌品系的(742.51±65.39 mg/g FW)(P<0.05)，但與其他品系間并無顯著差異(P>0.05)(圖3: B)。

圖3 4個斑翅果蠅品系3齡幼蟲體內(nèi)的糖原(A)和游離脂肪酸(B)含量Fig. 3 Contents of glycogen (A) and free fatty acids (B) in the 3rd instar larvae of four Drosophila suzukii strains

2.4 兩種腸道細菌對斑翅果蠅幼蟲抗氧化酶活性的影響

弗氏檸檬酸桿菌感染品系中3齡幼蟲體內(nèi)的SOD活力(208.65±35.37 U/g FW)顯著高于其他3種品系(F=10.54,df=2,P<0.01)，其他品系間并無顯著差異(P>0.05)(圖4: A)。弗氏檸檬酸桿菌感染品系和產(chǎn)酸克雷伯氏菌感染品系3齡幼蟲體內(nèi)的POD活力顯著高于無菌品系和正常飼養(yǎng)品系的(F=2.83,df=2,P<0.01)，但無菌品系與正常飼養(yǎng)的品系之間的差異并不顯著(P>0.05)(圖4: B)。弗氏檸檬酸桿菌感染品系和產(chǎn)酸克雷伯氏菌感染品系3齡幼蟲體內(nèi)的CAT活力顯著低于無菌品系的(F=12.33,df=2,P<0.01)，正常飼養(yǎng)品系的3齡幼蟲體內(nèi)CAT活力顯著低于產(chǎn)酸克雷伯氏菌感染品系的(F=10.46,df=2,P<0.01)，但與弗氏檸檬酸桿菌感染品系間并無顯著差異(P>0.05)(圖4: C)。

圖4 4個斑翅果蠅品系3齡幼蟲體內(nèi)的SOD(A), POD(B)和CAT (C)活力Fig. 4 Activities of SOD (A), POD (B) and CAT (C) in the 3rd instar larvae of four Drosophila suzukii strains

3 結(jié)論與討論

共生菌的消除對寄主昆蟲的生長發(fā)育會起到消極的作用，表現(xiàn)為體重下降和繁殖力下降(Guoetal., 2017)。本研究中通過卵的表面消毒實現(xiàn)了斑翅果蠅3齡幼蟲無菌的目的，表現(xiàn)為卵孵化率降低、體重下降和化蛹率降低，表明其生長發(fā)育受到了影響。而弗氏檸檬酸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌的喂回，在一定程度上緩解了生長發(fā)育的負面影響，說明這兩種菌在斑翅果蠅的生態(tài)適應(yīng)性中具有重要作用。在利用雄性不育技術(shù)防治地中海實蠅Ceratitiscapitata和橘小實蠅Bactroceradorsalis的過程中，提高不育昆蟲的生態(tài)適合度是其中的關(guān)鍵技術(shù)，在地中海實蠅的幼蟲飼料中添加克雷伯氏菌和弗氏檸檬酸桿菌，可以有效改善地中海實蠅的體長、體重、飛行能力和適合度(Hamdenetal., 2013; Kyritsisetal., 2017)。產(chǎn)酸克雷伯氏菌也可以通過提高橘小實蠅對食物的攝取量、增加糖類和氨基酸的代謝水平來彌補橘小實蠅代謝活力的下降(Caietal., 2018)。

本研究中，與無菌斑翅果蠅品系體內(nèi)的糖原(圖3: A)和氨基酸(圖2: B)含量相比，弗氏檸檬酸桿菌或克雷伯氏菌的加入降低了糖原和氨基酸的含量，這可能是由于細菌增殖過程中需要消耗糖類和氨基酸，因此提高了兩種物質(zhì)的代謝水平；本研究中也證明了，與無菌斑翅果蠅品系相比，弗氏檸檬酸桿菌或克雷伯氏菌的加入提高了斑翅果蠅體內(nèi)蛋白質(zhì)的水平(圖2: A)，這是因為氨基酸代謝水平上升會導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量提高，顯然，這些生理變化可補充斑翅果蠅體內(nèi)蛋白質(zhì)的缺乏。這與前人的研究結(jié)果相一致。另外，與無菌品系相比，單一弗氏檸檬酸桿菌感染的品系體內(nèi)的游離脂肪酸含量也明顯降低(圖3: B)，這可能是由于弗氏檸檬酸桿菌將斑翅果蠅腸道內(nèi)的糖原分解后更多地用于自身的增殖和斑翅果蠅的營養(yǎng)需要，合成的脂肪含量降低，使斑翅果蠅脂類的代謝受到了抑制，從而游離脂肪酸含量下降，但其具體的代謝過程仍需要多種代謝物和相關(guān)酶類的檢測來進行驗證。

消除掉共生菌以及單一共生菌感染后，斑翅果蠅自身會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。本研究通過測定4種斑翅果蠅品系體內(nèi)抗氧化酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)與正常飼養(yǎng)的果蠅品系相比，弗氏檸檬酸桿菌的添加使3齡幼蟲體內(nèi)SOD活力顯著提高(圖4: A)，而弗氏檸檬酸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌的存在對POD的活力也有促進作用(圖4: B)，但對CAT活力有抑制作用(圖4: C)，因此兩種菌對斑翅果蠅抗氧化酶的活力均有不同程度的影響，對有機體具有保護作用。多項研究表明，弗氏檸檬酸桿菌和克雷伯氏菌是昆蟲的有益菌，可提高昆蟲抵御外界不良環(huán)境的能力(Hussenederetal., 2017)。蔥地種蠅D.antigua幼蟲腸道中的弗氏檸檬酸桿菌和增強性沙雷菌Serratiaplymuthica等細菌可以抑制白僵菌菌絲和孢子的生長，增加蔥地種蠅對白僵菌的抗性(Zhouetal., 2019)。橘小實蠅體內(nèi)的弗氏檸檬酸桿菌在敵百蟲等有機磷殺蟲劑的降解過程中起關(guān)鍵作用，經(jīng)抗生素處理的桔小實蠅對敵百蟲的抗性明顯降低(Chengetal., 2017)，這可能是桔小實蠅對有機磷殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的原因之一。

除此之外，這兩種菌還可促進寄主昆蟲的交配行為。例如，桔小實蠅雌蟲腸道中的產(chǎn)酸克雷伯氏菌可以吸引雄蟲進行交配(Wangetal., 2014; Damodarametal., 2016)；瓜實蠅B.cucurbitae中腸中的克雷伯氏菌和檸檬酸桿菌其培養(yǎng)上清液中含有大量的3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、異氰酸丁酯、2-甲基-1-丙醇和3-羥基-2-丁烷，可吸引瓜實蠅雌蟲完成交配行為(Hadapadetal., 2016)。因此，共生細菌對寄主昆蟲具有一定的引誘潛力，可為生態(tài)友好型昆蟲防治提供參考。本研究發(fā)現(xiàn)弗氏檸檬酸桿菌和克雷伯氏菌對斑翅果蠅的生長發(fā)育和代謝過程均有影響，但對其機制及生態(tài)適應(yīng)性意義還需要進一步的研究。