陳 笛 姜 珂 周 鑫 曹獻(xiàn)英 -

(海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 海口 570228)

IgE介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)又稱過(guò)敏反應(yīng)，是由包括某些食物、灰塵、螨蟲(chóng)和花粉等許多過(guò)敏原引發(fā)的炎癥反應(yīng)。這些過(guò)敏原與肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE抗體特異性結(jié)合，從而激活肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞，使其釋放具有生物學(xué)活性的介質(zhì)，如顆粒相關(guān)介質(zhì)、細(xì)胞因子和炎性脂質(zhì)，導(dǎo)致過(guò)敏性炎癥反應(yīng)[1-2]。IgE介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)包括濕疹、過(guò)敏性鼻炎或特應(yīng)性皮炎等，嚴(yán)重情況下會(huì)造成虛脫和休克，甚至危及生命[3]。目前常采用的治療方法是藥物控制，抗過(guò)敏藥物雖然起效快，但副作用大，容易產(chǎn)生耐藥性。開(kāi)發(fā)具有抗過(guò)敏效應(yīng)的保健食品，彌補(bǔ)傳統(tǒng)藥物療法不足顯得尤其重要[4]?？惯^(guò)敏保健食品主要來(lái)源植物提取物，其有效成分包括黃銅類、萜類、醌類和生物堿等，近幾年，許多研究[5-6]還報(bào)道益生菌、海藻多糖和食源性寡肽等也具有抗過(guò)敏效應(yīng)。

作為一種熱帶特色食物，腰果因其富含脂質(zhì)(45%～50%)和蛋白質(zhì)(21%)的高營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)而被重視。目前關(guān)于腰果的研究主要集中在腰果酚和腰果油[7]，對(duì)腰果蛋白研究主要停留在研究其結(jié)構(gòu)特性，未見(jiàn)有探究腰果寡肽的功能作用的報(bào)道。腰果蛋白是具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，是獲得功能性肽的潛在資源[8]。純化鑒定腰果寡肽不僅可以為深度開(kāi)發(fā)腰果資源提供理論數(shù)據(jù)，還可以延長(zhǎng)腰果深加工產(chǎn)業(yè)鏈。試驗(yàn)擬以腰果蛋白為原料，通過(guò)酶解法制備腰果粗寡肽，采用葡聚糖凝膠柱和C18柱連續(xù)分離純化獲得腰果寡肽，探討其抗過(guò)敏效應(yīng)，以期為開(kāi)發(fā)具有抗過(guò)敏效應(yīng)的保健食品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腰果蛋白：實(shí)驗(yàn)室自制；

P815小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；

透明質(zhì)酸酶和透明質(zhì)酸鈉：上海阿拉丁生化有限公司；

anti-DNP-IgE：美國(guó)Sigma公司；

DNP-BSA：美國(guó)Biosearch公司；

4-硝基苯-N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷：上海源葉生物科技有限公司；

組胺試劑盒：長(zhǎng)沙達(dá)爾鋒生物科技有限公司；

其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

半制備型液相：LC-20AP型，日本島津公司；

高效液相色譜儀：1260型，配全波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技公司；

流式細(xì)胞儀：CytoFLEX型，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特生物科技有限公司；

二氧化碳培養(yǎng)箱：MCD-175型，日本三洋公司；

倒置顯微鏡：CKX31型，日本奧林巴斯有限公司；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-1FD型，蘇凈安泰設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶的篩選 根據(jù)楊雪等[9]的酶解法制備腰果粗寡肽。分別用堿性蛋白酶(絲氨酸蛋白酶、pH 10.0，60 ℃)、中性蛋白酶(沙雷肽酶、pH 7.0，50 ℃)、木瓜蛋白酶(pH 7.0，50 ℃)、菠蘿蛋白酶(pH 8.0，55 ℃)和復(fù)合蛋白酶(pH 7.0，50 ℃)酶解腰果蛋白。水解度(DH)采用甲醛滴定法[10]檢測(cè)，多肽得率(TCA-YSP)根據(jù)潘進(jìn)權(quán)等[11]的方法測(cè)定。

1.3.2 腰果寡肽的分離純化 用截留分子量為10 kDa和3 kDa超濾離心管在4 ℃條件下離心，分別收集濾過(guò)和未濾過(guò)溶液，得到3種不同分子量范圍的腰果粗寡肽。樣品經(jīng)Sephadex-G15和Sephadex-G50純化，凝膠填料的玻璃層析柱(1.6 cm×50 cm)，樣品用超純水配制為100 mg/mL，取1 mL加入已平衡的層析柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。半制備色譜條件：

① 上樣條件：樣品用含0.1%三氟乙酸的超純水配制為100 mg/mL，取1 mL加入色譜柱；

② 色譜柱：ODS HYPERSIL制備柱(Φ250 mm×10 mm，5 μm)；

③ 紫外檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；

④ 流動(dòng)相：A為含0.05% TFA的乙腈，B為含0.05% TFA的超純水；

⑤ 梯度洗脫：0～15 min，0%～30%的流動(dòng)相A、15～25 min，30%～35%的流動(dòng)相A、25～40 min，35%～40%的流動(dòng)相A。

1.3.3 腰果寡肽純度和結(jié)構(gòu)鑒定 采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)測(cè)定純度。RP-HPLC的樣品用含0.1% 三氟乙酸的超純水溶解，上樣濃度為100 mg/mL，0.45 μm濾膜過(guò)濾。色譜柱為Symmetyr C18色譜柱(Φ250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫25 ℃，其他色譜條件同1.3.2。

利用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)樣品定性分析，樣品在500～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。質(zhì)譜分析使用SCIEX公司的TripleTOF 5600液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行。肽段樣品通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器吸入后結(jié)合至C18捕獲柱(5 μm，5 mm×0.3 mm)，接著被洗脫至分析柱(75 μm×150 mm，3 μm 徑，10 nm孔徑)進(jìn)行分離。利用兩個(gè)流動(dòng)相(流動(dòng)相A：水+0.1%甲酸；流動(dòng)相B：乙腈+0.1%甲酸)建立30 min的分析梯度(0 min 5% B；15 min 5%～35% B；1 min 35%～80% B；5 min 80% B；0.1 min 80%～5% B；8.9 min 5% B)。液相的流速設(shè)置為300 nL/min。質(zhì)譜IDA模式分析時(shí)，每個(gè)掃描循環(huán)中包含一個(gè)MS全掃描(m/z范圍是350～1 500，離子累積時(shí)間250 ms)，以及隨后跟著的40個(gè)MS/MS掃描(m/z范圍是100～1 500，離子累積時(shí)間50 ms)。MS/MS采集的條件設(shè)置為母離子信號(hào)>120 cps，電荷數(shù)為+2～+5。離子重復(fù)采集的排除時(shí)間設(shè)置為18 s。

1.3.4 透明質(zhì)酸酶抑制率測(cè)定 采用Elson-Morgan 改良法[12]。

1.3.5 細(xì)胞脫顆粒測(cè)定

(1) 敏化細(xì)胞：調(diào)整P815細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，取48孔板，每孔加190 μL細(xì)胞懸液和10 μL終濃度為0.5 μg/mL anti-DNP-IgE，培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)孵育過(guò)夜[13]。

(2) 刺激細(xì)胞：次日棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌敏化后的細(xì)胞3遍，空白對(duì)照組和模型組每孔加190 μL Tyrode’s緩沖液，試驗(yàn)組每孔加190 μL溶于Tyrode’s緩沖液的樣品溶液，樣品終濃度為50，200，500 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。樣品孵育1 h后，空白對(duì)照組加10 μL Tyrode’s緩沖液，模型組和試驗(yàn)組加10 μL終濃度為0.5 μg/mL DNP-BSA刺激敏化細(xì)胞1 h，收集細(xì)胞上清液于1.5 mL EP管中。

(3) 檢測(cè)β-氨基己糖甘酶(β-HEX)釋放率：參照Bansod等[14]的方法，按式(1)計(jì)算β-HEX釋放率。

(1)

式中：

c——β-HEX釋放率，%；

m1——上清液中β-HEX的OD值；

m2——細(xì)胞裂解液中β-HEX的OD值。

(4) 檢測(cè)上清液中組胺釋放量：按1.3.5(1)和1.3.5(2)的方法處理細(xì)胞，收集上清液，根據(jù)組胺試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)上清液中組胺的含量。

(5) 磷脂酰絲氨酸外翻測(cè)定：收集2×105個(gè)細(xì)胞，用500 μL結(jié)合液重懸，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用單因素方差分析，比較結(jié)果間的差異性(P<0.05差異顯著；P<0.01差異極顯著)，采用Graphpad Prism7.0完成繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶的酶解能力比較

如表1所示，堿性蛋白酶酶解液的DH和TCA-YSP明顯高于其他蛋白酶，分別為(17.06±1.52)%，(26.28±0.13)%，說(shuō)明堿性蛋白酶是5種蛋白酶中分解效率較高的蛋白酶，此結(jié)果與He等[15]的研究結(jié)果一致。DH和TCA-YSP與酶切位點(diǎn)和底物溶解性有關(guān)，蛋白酶的酶切位點(diǎn)越廣泛和底物溶解度越高可獲得更高DH和TCA-YSP[16]。堿性蛋白酶具有眾多的酶切位點(diǎn)且腰果蛋白在其最適pH范圍內(nèi)溶解度最高，因此，后續(xù)研究均選擇堿性蛋白酶為水解酶。

表1 不同酶制備的酶解液水解度(DH)和多肽得率 (TCA-YSP)?

Table 1 Degree of hydrolysis (DH) and TCA-soluble peptide yield (TCA-YSP) of hydrolysates prepared by different enzyme (n =6) %

蛋白酶DHTCA-YSP堿性蛋白酶26.28±0.14a17.06±1.5a復(fù)合蛋白酶21.76±0.47c7.16±0.71c中性蛋白酶23.47±0.47b5.29±0.56d木瓜蛋白酶13.18±0.34c2.96±0.27e菠蘿蛋白酶21.94±0.61d9.39±0.65b

? 同列小寫(xiě)字母不同表示不同蛋白酶的DH和TCA-YSP之間具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 腰果寡肽的分離純化

由圖1可知，分子量<3 kDa組分的透明質(zhì)酸酶抑制率顯著高于分子量>10 kDa和3～10 kDa的組分(P<0.05)，說(shuō)明具有抗過(guò)敏效應(yīng)的成分主要集中在分子量<3 kDa的組分中。F1-a組分的透明質(zhì)酸酶抑制率為(93.93±0.38)%，顯著(P<0.05)高于F1-b組分，說(shuō)明F1組分中主要是F1-a起作用。

字母不同表示不同組分之間具有顯著性差異(P<0.05)圖1 各組分的透明質(zhì)酸酶抑制率Figure 1 Hyaluronidase inhibition rate of each component

圖2表示分子量<3 kDa的組分經(jīng)Sephadex-G15層析柱脫鹽處理得F1組分，F(xiàn)1組分經(jīng)Sephadex-G50層析柱得到兩個(gè)組分F1-a和F1-b(如圖3所示)。

從F1-a的柱層析分離譜圖的峰形和峰強(qiáng)來(lái)看，F(xiàn)1-a組分在分子量<3 kDa組分中含量較高，且純度高于F1-b組分。因此，后續(xù)將F1-a組分應(yīng)用到半制備液相。

圖2 腰果粗寡肽經(jīng)Sephadex G-15凝膠柱層析分離譜圖

Figure 2 Chromatography spectrum of cashew nut crude oligopeptides separated on sephadex G-15 gel column

圖3 腰果粗寡肽經(jīng)Sephadex G-50凝膠柱層析分離譜圖

Figure 3 Separex G-50 gel column chromatography spectrum of cashew nut crude oligopeptides

F1-a組分經(jīng)制備型C18柱分離后得到一個(gè)組分F1-a-1(如圖4所示)。F1-a-1峰強(qiáng)較高，說(shuō)明其在F1-a組分含量占比高，且F1-a-1組分對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率為(95.53±2.75)%，因此，將F1-a-1組分用于進(jìn)一步探究其抗過(guò)敏效應(yīng)及機(jī)制。

2.3 腰果寡肽的純度和結(jié)構(gòu)特性

圖5、6分別為F1-a-1組分的RP-HPLC圖譜和傅里葉紅外光譜圖。

圖4 F1-a組分經(jīng)半制備型液相分離譜圖Figure 4 Spectrum of F1-a components separated by semi-preparative liquid phase

圖5 F1-a-1組分的RP-HPLC圖譜Figure 5 RP-HPLC spectrum of the F1-a-1 component

圖6 F1-a-1組分的紅外光譜圖Figure 6 Infrared spectrum of the F1-a-1 component

由圖5可知，F(xiàn)1-a-1組分雜峰較少，說(shuō)明F1-a-1組分純度較高。圖6表明，F(xiàn)1-a-1組分在1 654.5～1 403.1 cm-1處的吸收峰為酰胺鍵的特征吸收，這是蛋白質(zhì)的典型特征[17]。3 422.4 cm-1處可能是N—H和O—H的吸收，2 926.6 cm-1處的吸收峰可能是—CH3的伸縮振動(dòng)，1 099.4 cm-1和600.6 cm-1的吸收可能是—NH2的伸縮振動(dòng)[18]。酰胺I帶(1 700～1 600 cm-1)是蛋白質(zhì)骨架的最突出和最敏感的振動(dòng)帶，與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。波數(shù)在1 660～1 695 cm-1范圍為β-轉(zhuǎn)角，1 650～1 658 cm-1范圍為α-螺旋，1 640～1 650 cm-1范圍為無(wú)規(guī)則卷曲，1 610～1 640 cm-1范圍為β-折疊[19]。圖6中F1-a-1組分在1 654.5 cm-1有伸縮振動(dòng)，說(shuō)明該組分中含有α-螺旋。

F1-a-1組分經(jīng)質(zhì)譜鑒定為氨基酸序列Ile-Ile-Ala-Ile-Pro-Ala-GIy-Val-Ala-His(IIAIPAGVAH)的腰果寡肽(圖7)。

圖7 F1-a-1組分的二級(jí)質(zhì)譜圖Figure 7 Tandem mass spectrum of the F1-a-1 component

腰果寡肽含有多個(gè)異亮氨酸，表明其具有α-螺旋結(jié)構(gòu)傾向[20]，與其紅外圖譜結(jié)果一致。該寡肽中不含芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸等胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)，且寡肽中的脯氨酸殘基可能會(huì)在肽鏈上賦予獨(dú)特的構(gòu)象約束，可防止其在胃腸消化中被分解，保留活性[21]。在腰果寡肽純化過(guò)程中，從1 000 g脫脂腰果粉可制備29.17 g腰果酶解產(chǎn)物，經(jīng)純化后可獲得0.10 g腰果寡肽，由此可知，腰果寡肽得率為0.01%。在BIOPEP、PDB(the protein databank)和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索了該序列，但未找到相應(yīng)的寡肽，提示試驗(yàn)中獲得的腰果寡肽之前未被發(fā)現(xiàn)。

腰果寡肽的分子量為960.5 Da，分子量低的肽段可改善其在腸道中吸收并使其加速通過(guò)腸道屏障，產(chǎn)生生理效應(yīng)[22]。另外研究[23]表明，只有多肽的分子量≥3.5 kDa才能與肥大細(xì)胞上IgE抗體交聯(lián)引起過(guò)敏反應(yīng)，分子量小的寡肽與IgE的交聯(lián)能力低，甚至可以競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)過(guò)敏原的結(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)生抗過(guò)敏效應(yīng)。根據(jù)上述結(jié)果，將腰果寡肽用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 腰果寡肽的抗過(guò)敏效應(yīng)

2.4.1 對(duì)P815細(xì)胞脫顆粒的影響 由圖8(a)可知，空白對(duì)照組P815細(xì)胞上清液中組胺濃度為(0.20±0.01) ng/mL；DNP-BSA刺激后上清液中組胺濃度為(0.89±0.05) ng/mL，顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)；200，500 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同孵育后，上清液中組胺濃度分別為(0.55±0.02)，(0.51±0.07) ng/mL，顯著低于僅用DNP-BSA刺激后上清液中的組胺濃度。組胺是由組氨酸脫氫酶脫羧形成，儲(chǔ)存在正常肥大細(xì)胞中的分泌顆粒中，主要通過(guò)特異性組胺受體發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，當(dāng)肥大細(xì)胞受過(guò)敏原刺激后，隨著脫顆粒分泌到胞外，引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)[24]。組胺僅存在于嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞中，可將組胺釋放量作為衡量肥大細(xì)胞脫顆粒強(qiáng)弱的重要標(biāo)志物[25]。組胺雖為脫顆粒反應(yīng)最典型的標(biāo)志物，但它是一種極不穩(wěn)定物質(zhì)，半衰期短，要求迅速采集樣品并且快速檢測(cè)，因此，還需要結(jié)合其他指標(biāo)做綜合判斷。

如圖8(b)所示，DNP-BSA刺激后，P815細(xì)胞β-氨基己糖苷酶釋放率為(45.23±3.42)%，顯著高于空白對(duì)照組的[(7.73±0.96)%]，而200，500 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同孵育后，β-氨基己糖苷酶釋放率顯著降低(P<0.01)。綜上所述，腰果寡肽顯著抑制P815細(xì)胞中組胺和β-氨基己糖苷酶分泌，且濃度為200 μg/mL達(dá)到顯著抑制。

β-氨基己糖苷酶是一種類胰蛋白酶，儲(chǔ)存在肥大細(xì)胞分泌顆粒中[24]。正常情況下人體血液中幾乎不含有β-氨基己糖激酶，當(dāng)肥大細(xì)胞接觸過(guò)敏原后，β-氨基己糖苷酶釋放程度增加，其釋放量與細(xì)胞脫顆粒程度存在量效關(guān)系。目前常用此指標(biāo)作為肥大細(xì)胞活化脫顆粒的標(biāo)志[26]。

A. 正常細(xì)胞 B. DNP-BSA誘導(dǎo)的細(xì)胞 C. 50 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同作用于細(xì)胞 D. 200 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同作用于細(xì)胞 E. 500 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同作用于細(xì)胞 ##. P<0.01與空白組相比 **. P<0.01與模型組相比

圖8 腰果寡肽對(duì)IgE-抗原復(fù)合物刺激的P815細(xì)胞組胺釋放量和β-氨基己糖苷酶胺釋放率的影響

Figure 8 Effect of cashew nut oligopeptide on histamine andβ-aminohexosidase amine release of P815 cells stimulated by IgE-antigen complex (n=6)

A. 正常細(xì)胞 B. DNP-BSA誘導(dǎo)的細(xì)胞 C. 50 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同作用于細(xì)胞 D. 200 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同作用于細(xì)胞 E. 500 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同作用于細(xì)胞 ##. P<0.01與空白組相比 **. P<0.01與模型組相比

圖9 F1-a-1組分對(duì)IgE-抗原復(fù)合物刺激的P815細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外翻的影響

Figure 9 Effect of F1-a-1 components on phosphatidylserine eversion of P815 cells stimulated by IgE-antigen complex (n=6)

2.4.2 腰果寡肽對(duì)磷脂酰絲氨酸外翻的影響 通過(guò)圖9(a)畫(huà)出P1門(mén)，即具有完整形態(tài)細(xì)胞的區(qū)域。基于P1門(mén)，得到P2門(mén)，即含有熒光探針細(xì)胞的區(qū)域，如圖9(b)所示。各組P2門(mén)的平均熒光強(qiáng)度如圖9(c)所示，與模型組相比，200 μg/mL和500 μg/mL腰果寡肽孵育后的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明腰果寡肽可抑制P815細(xì)胞脫顆粒，具有抗過(guò)敏效應(yīng)。

肥大細(xì)胞脫顆粒的過(guò)程是通過(guò)胞吐作用將顆粒內(nèi)的活性物質(zhì)釋放到胞外，熒光標(biāo)記的Annexin V抗體可特異性地與脫顆粒過(guò)程中細(xì)胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，可用流式細(xì)胞儀測(cè)定，平均熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，磷脂酰絲氨酸外翻程度越強(qiáng)，即細(xì)胞脫顆粒程度越強(qiáng)。有研究[27]顯示，Annexin V可以和細(xì)胞表面分泌顆粒發(fā)生特異性結(jié)合，結(jié)合程度與β-氨基己糖苷酶釋放呈正比。

3 結(jié)論

研究以腰果蛋白為原料，依據(jù)不同蛋白酶的DH和TCA-YSP，確定堿性蛋白酶為制備腰果粗寡肽的最佳用酶；利用超濾、分子篩及半制備液相，從腰果粗寡肽中分離出含有α-螺旋且氨基酸序列為Ile-Ile-Ala-Ile-Pro-Ala-GIy-Val-Ala-His(IIAIPAGVAH)的腰果寡肽。通過(guò)測(cè)定腰果寡肽對(duì)肥大細(xì)胞中組胺和β-氨基己糖苷酶釋放及磷脂酰絲氨酸外翻的影響，證明其有抗過(guò)敏效應(yīng)。后續(xù)研究需進(jìn)一步探究腰果寡肽在分子水平上的抗過(guò)敏機(jī)制。