李如霞 白小莉 俞棋英 孫妍 李巧玲 李孟榮

機體對過敏原的易感性是引起過敏性疾病的重要危險因素，近幾十年世界各地過敏性疾病發(fā)生率呈逐年增長趨勢[1]。塵螨抗原（Der p）是誘發(fā)過敏性哮喘和鼻炎最常見的室內(nèi)過敏原[2]。肥大細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的中間細(xì)胞及效應(yīng)細(xì)胞，主要分布于與外界過敏原密切接觸的組織表面，并在過敏性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮核心作用[3]。1,25（OH）2D3是維生素D的活性形式，有研究報道能下調(diào)登革熱病毒感染的巨噬細(xì)胞Th2型細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)，高劑量1,25（OH）2D3能上調(diào)IL-10分泌[4]。目前關(guān)于1,25（OH）2D3對肥大細(xì)胞生物學(xué)作用的研究甚少。本研究通過觀察Der p以及1,25（OH）2D3聯(lián)合Der p直接作用于P815肥大細(xì)胞后維生素D受體（VDR）表達(dá)及 IL-4、IL-10分泌的變化，探討1,25（OH）2D3的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱（Heal Force 90，美國Thermo），RT-PCR儀（美國Roche），電泳槽（Dycp-31BM，北京市六一儀器廠），生物電泳圖像分析（FR-980），倒置顯微鏡（日本NIKON），熒光顯微鏡（日本OLYMPUSCX21FS1），圖像分析軟件（美國Image-Pro plus 6.0）。小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞P815（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心），純化塵螨提取液（有效成分Der p，丹麥ALK-Abello），1,25（OH）2D3（美國Sigma）；抗維生素D受體抗體（ab3508，英國Abcam），異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），高糖培養(yǎng)基（DMEM）、FBS（美國Gibco），RT-PCR 試劑盒（美國 Fermentas），Trizol抽提試劑、聚偏二氟乙烯膜（PVDF）（美國 Invitrogen），核苷酸膠體染料（SYBR Green I Stain）（美國 Roche），核酸染色劑（Gold View）、蛋白定量試劑盒（BCA）（中國 SalarBio），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（美國 Bioworld），小鼠IL-4、IL-10 ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物MULTI SCIENCES）；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 P815肥大細(xì)胞置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，并放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中隔天傳代一次。計數(shù)2×105/ml細(xì)胞并培養(yǎng)24h后，分別用Der p（0、0.000 1、0.001、0.01、0.1μg/ml）及 1,25-（OH）2D3（10-12、10-10、10-8mol/L） 單獨或聯(lián)合作用 P815 肥大細(xì)胞，其中聯(lián)合作用分組情況如下：0μg/ml Der p+0mol/L 1,25（OH）2D3為Ⅰ組，0.1μg/ml Der p 為Ⅱ組，0.1μg/ml Der p+10-12mol/L 1,25（OH）2D3為Ⅲ組，0.1μg/ml Der p+10-10mol/L 1,25（OH）2D3為Ⅳ組，0.1μg/ml Der p+10-8mol/L 1,25（OH）2D3為Ⅴ組；分別于 2、6、12、24、36h終止反應(yīng)，室溫離心10min后收集上清液，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列

1.3 免疫熒光細(xì)胞染色及瓊脂糖凝膠電泳驗證P815肥大細(xì)胞上表達(dá)VDR （1）免疫熒光細(xì)胞染色：小鼠肥大細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定15min后，PBS洗5min，Triton-X 100穿孔 15min，PBS洗 5min×3次，用 5%BSA 封閉30min，加入1%BSA稀釋的一抗，放入濕盒，4℃過夜，PBS洗5min×3次，加入1%BSA稀釋的熒光二抗，置于 37℃避光孵育 60min，PBS洗 5min×3次，制片，在熒光顯微鏡下觀察肥大細(xì)胞VDR表達(dá)。（2）瓊脂糖凝膠電泳：配制2%的瓊脂糖凝膠，膠膜中放好梳子，將凝膠倒入膠膜中，室溫下靜置30min，使膠充分冷卻并凝固，移去梳子，將凝膠放入電泳槽。加入0.5×TBE電泳緩沖液，使液面高出凝膠約1mm，取需檢測基因PCR產(chǎn)物4μl，加入5×上樣緩沖液1μl充分震蕩混勻，加入加樣孔中，留出一孔加入 DNA Marker 5μl，120V恒壓電泳，使DNA向陽極方向泳動。40min后停止電泳，取出凝膠，用FR-980生物電泳圖像分析系統(tǒng)獲取凝膠圖像。

1.4 肥大細(xì)胞中VDR mRNA表達(dá)的檢測 采用RTPCR法。收集培養(yǎng)的肥大細(xì)胞，使用Trizol Reagent提取細(xì)胞總RNA，使用多功能酶標(biāo)儀測定RNA含量及純度。根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成，逆轉(zhuǎn)錄條件如下：42℃ 1h，72℃ 5min。每個反應(yīng)體系包括5μl的 SYBR Green I Stain，1μl的 10μmol/L 引物，1μl的cDNA，加雙蒸水至總體積為10μl；擴增條件：95℃10min，95℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s；共 45 個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后用Roche Light Cycler 480軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，目標(biāo)基因表達(dá)差異以經(jīng)過處理的樣本相對于未經(jīng)處理的樣本的倍數(shù)表示，即檢測基因的差異=2-ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt未處理組）。

1.5 肥大細(xì)胞中VDR蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法。收集培養(yǎng)的肥大細(xì)胞，用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離VDR蛋白，濕式電轉(zhuǎn)移進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，再以5%%脫脂奶粉室溫封閉2h，4℃搖箱中一抗孵育過夜，一抗?jié)舛?1∶1 000，等滲緩沖溶液（TBST）洗 5min×3次，室溫下孵育二抗2h，二抗?jié)舛?∶5 000，TBST洗15min×3次，滴加化學(xué)發(fā)光檢測試劑，用Gel-Pro凝膠分析軟件分析。蛋白相對表達(dá)水平=目的蛋白條帶累積光密度/內(nèi)參條帶累積光密度。

1.6 肥大細(xì)胞上清液中IL-4、IL-10濃度的檢測 采用ELISA法。使用小鼠IL-4、IL-10 ELISA試劑盒檢測上述實驗收集的肥大細(xì)胞懸液上清液中IL-4、IL-10濃度，按說明書進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VDR在P815肥大細(xì)胞上的表達(dá) 免疫熒光細(xì)胞染色及瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，P815肥大細(xì)胞上表達(dá)VDR，見圖1（插頁）和圖2。

圖1 免疫熒光細(xì)胞染色驗證P815肥大細(xì)胞上表達(dá)VDR（a：不加VDR單克隆抗體；b：加VDR單克隆抗體，綠色熒光為陽性表現(xiàn)；c-d：DAPI染色后顯示的細(xì)胞核；×400）

圖2 P815肥大細(xì)胞上VDR表達(dá)的電泳圖

2.2 Der p對P815肥大細(xì)胞VDR表達(dá)的影響 不同濃度 Der p 作用 P815 肥大細(xì)胞 2、6、12、24、36h 后，VDR mRNA表達(dá)均有不同程度下降，在12、24h作用組，VDR mRNA表達(dá)呈濃度依賴性下降（均P＜0.05），見圖3。不同濃度Der p作用P815肥大細(xì)胞36h后，VDR蛋白表達(dá)呈濃度依賴性下調(diào)，見圖4。

圖3 不同濃度Der p作用P815肥大細(xì)胞2、6、12、24、36h后VDR mRNA表達(dá)

2.3 1,25（OH）2D3對P815肥大細(xì)胞VDR表達(dá)及IL-4、IL-10分泌的影響 與0mol/L組比較，10-12、10-10mol/L的1,25（OH）2D3作用后P815肥大細(xì)胞VDR mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；10-8mol/L的1,25（OH）2D3作用后P815肥大細(xì)胞VDR mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與0mol/L組比較，10-12mol/L的1,25（OH）2D3作用后 P815肥大細(xì)胞VDR蛋白表達(dá)差異不明顯；10-10mol/L、10-8mol/L的1,25（OH）2D3作用后P815肥大細(xì)胞VDR蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，見圖5。不同濃度1,25（OH）2D3作用P815肥大細(xì)胞36h后，IL-4濃度變化不明顯（P＞0.05）；而10-10mol/L、10-8mol/L 的 1,25（OH）2D3作用后 P815 肥大細(xì)胞上清液中IL-10濃度較0mol/L組均明顯升高（均P＜0.05），見圖 6。

圖4 不同濃度Der p作用P815肥大細(xì)胞36h后VDR蛋白表達(dá)的電泳圖（a：0μg/ml；b：0.0001μg/ml；c：0.001μg/ml；d：0.01μg/ml；e：0.1μg/ml）

2.4 Der p聯(lián)合1,25（OH）2D3作用P815肥大細(xì)胞36h后對VDR表達(dá)及IL-4、IL-10分泌的影響 與Ⅰ組比較，Ⅱ組P815肥大細(xì)胞VDR mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組P815肥大細(xì)胞VDR mRNA表達(dá)均明顯升高（均P＜0.05）。Ⅱ組P815肥大細(xì)胞VDR蛋白表達(dá)較Ⅰ組明顯下調(diào)；Ⅱ組與Ⅲ組P815肥大細(xì)胞VDR蛋白表達(dá)變化不明顯；Ⅳ、Ⅴ組P815肥大細(xì)胞VDR蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。與Ⅰ組比較，Ⅱ組P815肥大細(xì)胞上清液中IL-4濃度明顯升高（P＜0.05），IL-10濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組P815肥大細(xì)胞上清液中IL-4濃度均明顯下降（均P＜0.05），且 1,25（OH）2D3濃度越高，IL-4濃度下降越明顯，而IL-10濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），見圖7-8。

圖5 不同濃度1,25（OH）2D3作用P815肥大細(xì)胞36h后VDR mRNA 及蛋白表達(dá)（a：0mol/L；b：10-12mol/L；c：10-10mol/L；d：10-8mol/L）

圖6 不同濃度1,25（OH）2D3作用P815肥大細(xì)胞36h后上清液中 IL-4、IL-10濃度變化（n=6）

圖7 Der p聯(lián)合1,25（OH）2D3作用P815肥大細(xì)胞 36h后VDR mRNA及蛋白表達(dá)

圖8 Der p聯(lián)合1,25（OH）2D3作用P815肥大細(xì)胞36h后上清液中 IL-4、IL-10濃度變化（n=6）

3 討論

過敏性疾病包括支氣管哮喘、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、變應(yīng)性皮炎、食物及藥物過敏等，目前關(guān)于過敏的產(chǎn)生機制尚未完全闡明，但是過敏原和易感個體的存在以及兩者之間的相互作用是導(dǎo)致過敏性疾病發(fā)生必不可少的因素。肥大細(xì)胞是過敏反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，在先天性和獲得性免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用。

國內(nèi)研究結(jié)果顯示，引起人類變態(tài)反應(yīng)性疾病的塵螨主要包括屋塵螨和粉塵螨，其抗原有多種亞型，不同Der p具有交叉反應(yīng)性，Der f1和Der p1均能誘導(dǎo)交叉反應(yīng)和產(chǎn)生種屬特異性抗體[5-6]。針對Der p2和Der f2的IgE抗體，幾乎呈完全交叉反應(yīng)；而且Der p2和Der f2在塵螨過敏性疾病患者皮試陽性中占極高的比例[7]。有文獻(xiàn)證明，Der f直接作用于P815肥大細(xì)胞，可以導(dǎo)致其表達(dá) TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-9 和 IL-13 增加[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度Der p作用于P815肥大細(xì)胞不同時間后，VDR mRNA及蛋白表達(dá)均減少，但無明顯濃度及時間依賴性變化，低濃度Der p對VDR表達(dá)的影響不明顯。0.1μg/ml Der p作用于P815肥大細(xì)胞36h后，上清液中IL-4濃度明顯升高，但I(xiàn)L-10濃度無明顯變化。因P815肥大細(xì)胞不表達(dá)IgE受體I（FcεRI），且本實驗未加入Der p特異的IgE抗體，故以上結(jié)果表明Der p對肥大細(xì)胞的直接作用可能是通過下調(diào)VDR表達(dá)，促進(jìn)IL-4的分泌，破壞Th1/Th2平衡，導(dǎo)致了Th2型免疫應(yīng)答增強，從而發(fā)揮其致炎作用。

Th1/Th2平衡是免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，Th1和Th2彼此相互抑制，呈動態(tài)平衡；如果這一平衡向Th2偏移，會使Th2型細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5、IL-13等）水平升高，而Th1型細(xì)胞因子（如IL-12、INF-γ等）水平降低[9]。IL-4是主要的抗原類別轉(zhuǎn)換因子，其可以引導(dǎo)被抗原激活的B淋巴細(xì)胞IgE抗體的產(chǎn)生增加，而IgE依賴的肥大細(xì)胞的激活在速發(fā)型超敏反應(yīng)中起核心作用[10]。IL-4還可以促進(jìn)組織肥大細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞增長[11]。此外，IL-4可以激活并且維持Th2細(xì)胞對過敏原的應(yīng)答反應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.1μg/ml Der p處理P815肥大細(xì)胞36h后，IL-4濃度較對照組明顯升高，提示Der p可通過促進(jìn)肥大細(xì)胞IL-4分泌，促進(jìn)Th2型免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。IL-10是一種具有強抗炎作用的細(xì)胞因子，因其可抑制Th1和Th2免疫應(yīng)答，故其對免疫介導(dǎo)的各種疾病，包括過敏性疾病、移植排斥反應(yīng)以及自身免疫性疾病等具有潛在的治療作用[12-13]。IL-10通過調(diào)節(jié)Th1/Th2型細(xì)胞因子的分泌、減少IgE的產(chǎn)生、誘導(dǎo)機體對過敏原產(chǎn)生免疫耐受等途徑減輕過敏性炎癥反應(yīng)[9]。已有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外周血衍化的CD3+、CD4+T細(xì)胞在1,25（OH）2D3作用下，IL-10 分泌呈濃度依賴性增加[14]。

維生素D通過它的活性形式1,25（OH）2D3發(fā)揮作用，其不僅對骨鹽代謝有調(diào)節(jié)作用，也能調(diào)節(jié)先天性和獲得性免疫應(yīng)答[15]。近幾十年來，很多動物實驗和臨床研究證實維生素D在治療過敏性疾病中的有效性。最近一項臨床研究結(jié)果顯示，補充維生素D可以明顯改善患兒的濕疹癥狀[16]。補充維生素D的哮喘小鼠，其氣道高反應(yīng)、氣道重塑以及支氣管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)和前炎癥細(xì)胞因子均明顯減少，而BALF中IL-10濃度及T調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)明顯增多[17]。脂多糖可以誘導(dǎo)小牛樹突狀細(xì)胞IL-10的分泌，而維生素D對其有促進(jìn)作用[18]。

本研究對細(xì)胞懸液上清液中IL-4、IL-10濃度的檢測結(jié)果顯示，不同濃度1,25（OH）2D3作用P815肥大細(xì)胞36h后，IL-4濃度無明顯變化，而IL-10濃度較對照組明顯升高，且1,25（OH）2D3濃度越大，IL-10濃度升高越明顯。0.1μg/ml Der p處理P815肥大細(xì)胞36h后，IL-4濃度較對照組明顯升高，但I(xiàn)L-10濃度與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。將1,25（OH）2D3、Der p同時處理P815肥大細(xì)胞36h后，IL-4濃度較Der p處理組明顯下降，且1,25（OH）2D3濃度越高，IL-4濃度下降越明顯?？梢姡珼er p單獨作用于P815肥大細(xì)胞可增加IL-4的分泌，但對IL-10水平無明顯影響；1,25（OH）2D3單獨作用于P815肥大細(xì)胞對IL-4水平無影響，但可增加IL-10的分泌，并抑制Der p的促IL-4釋放作用；而Der p可抑制1,25（OH）2D3的促IL-10釋放作用。筆者認(rèn)為，1,25（OH）2D3對Der p引起的肥大細(xì)胞炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用可能是通過抑制IL-4的合成和分泌，從而抑制Th2型免疫應(yīng)答的。

綜上所述，Der p直接作用于P815肥大細(xì)胞，使VDR表達(dá)下調(diào)及IL-4分泌增加，對IL-10分泌無明顯影響；高濃度1,25（OH）2D3單獨作用可上調(diào)VDR表達(dá)及促進(jìn)IL-10分泌，但對IL-4分泌無明顯影響；1,25（OH）2D3可以下調(diào)Der p引起的IL-4分泌，從而抑制Th2免疫應(yīng)答；1,25（OH）2D3可通過上調(diào)肥大細(xì)胞VDR表達(dá)，促進(jìn)IL-10分泌，從而發(fā)揮抗炎作用。關(guān)于1,25（OH）2D3對肥大細(xì)胞VDR表達(dá)的調(diào)節(jié)及引起細(xì)胞因子分泌的機制，目前尚不能完全解釋清楚，有待進(jìn)一步研究。