韓霜,何錕,張婧,張秀果,李建立,容俊芳

1 河北省人民醫(yī)院，石家莊050051；2石家莊市第四醫(yī)院

單肺通氣時機(jī)械剪切力、吸入高濃度氧以及萎陷側(cè)肺快速復(fù)張均可破壞血?dú)饨粨Q屏障，使細(xì)胞膜通透性增加，激活體內(nèi)的炎癥信號通路，導(dǎo)致白細(xì)胞和各種促炎因子聚集，加重肺組織損傷。細(xì)胞外組蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的重要炎性介質(zhì)，在感染、炎癥及免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[1]。研究[2]表明，術(shù)前霧化吸入布地奈德可有效改善肺通氣，減少單肺通氣時肺炎癥反應(yīng)。沙丁胺醇為選擇性β2受體激動劑，可激動支氣管平滑肌的β2受體，擴(kuò)張支氣管，增加纖毛清除功能，降低血管通透性，改善肺功能[3]。但布地奈德復(fù)合沙丁胺醇霧化吸入是否能減輕肺組織炎癥反應(yīng)尚不明確。2012年10月～2013月10月，本研究觀察了預(yù)霧化吸入布地奈德及沙丁胺醇是否對單肺通氣致兔肺損傷有預(yù)防作用,并探討了其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、儀器 健康雄性新西蘭大白兔24只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。TNF-1α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒(加拿大YES公司)，細(xì)胞外組蛋白ELISA測定試劑盒(德國 Roche 公司)，硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液(深圳大佛藥業(yè)有限公司)，布地奈德混懸液(阿斯利康制藥有限公司，英國)。HX-200動物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 布地奈德復(fù)合沙丁胺醇預(yù)霧化吸入方法及單肺通氣肺損傷兔模型的建立 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將兔隨機(jī)分為A、B、C組，各8只。3%的戊巴比妥鈉30 mg/kg耳緣靜脈麻醉后，行右側(cè)股動脈和左側(cè)股靜脈插管術(shù)。局部浸潤麻醉下行氣管切開，A組采用單腔氣管導(dǎo)管(ID 3.0 mm)置入氣管行雙肺通氣3 h。B、C組參照文獻(xiàn)[4,5]制備單肺通氣肺損傷模型，即采用自制雙腔氣管導(dǎo)管行左側(cè)單肺通氣2 h、雙肺通氣1 h。C組于單肺通氣前吸入沙丁胺醇0.15 mg/kg+布地奈德0.5 mg+生理鹽水共2 mL。A、B組均吸入等量生理鹽水。各組均采用容量通氣模式，通氣參數(shù)：VT 12 mL/K，F(xiàn)iO2100%，通氣頻率40次/min，I∶E為1∶2。

各組通氣結(jié)束后取右側(cè)肺下葉約1 cm×1 cm×2 cm肺組織，一部分用液氮凍存24 h后轉(zhuǎn)-80 ℃保存待測，另一部分用4 ℃多聚甲醛中固定肺組織常規(guī)石蠟包埋切片。取右側(cè)肺下葉行支氣管肺泡灌洗，生理鹽水5 mL,灌洗3次。支氣管肺泡灌洗液經(jīng)單層紗布過濾靜置10 min 后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清-80 ℃凍存。

1.3 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 采用HE染色，400倍光鏡下觀察肺組織病理學(xué)結(jié)果并行肺損傷程度評分。按照肺間質(zhì)水腫、肺泡水腫、中性粒細(xì)胞浸潤和肺泡內(nèi)充血評分：無改變或非常輕微為0分，輕度改變?yōu)?分，中度改變?yōu)?分，重度改變?yōu)?分，極重度改變?yōu)?分，累計(jì)4項(xiàng)指標(biāo)的總分。每張切片隨機(jī)選擇10個高倍視野，進(jìn)行10次評分，取平均值作為肺損傷評分。

1.4 肺濕/干質(zhì)量(W/D)及肺通透指數(shù)(LPI)測算 取右側(cè)肺上葉稱濕質(zhì)量(W)，置于80 ℃烘箱內(nèi)干燥72 h至恒重，稱肺干質(zhì)量(D)，計(jì)算肺W/D。LPI：取右肺下葉做肺泡灌洗，用5 mL生理鹽水分3 次進(jìn)行灌洗，灌洗液回收量在80%以上，離心，留取上清液。取靜脈血標(biāo)本離心留取血漿。采用ELISA法檢測灌洗液和血漿總蛋白(TP)。LPI=灌洗液TP/血清TP。

1.5 支氣管肺泡灌洗液TNF-1α、IL-6、IL-1β的測定 采用ELISA法按照試劑盒說明書步驟測定支氣管肺泡灌洗液中TNF-1α、IL-6及IL-1β。

1.6 血漿細(xì)胞外組蛋白測定 于霧化吸入前(T1)、通氣1 h(T2)、通氣2 h(T3)、通氣3 h(T4)采集靜脈血，分離血漿，采用 ELISA 法測定血漿細(xì)胞外組蛋白。

2 結(jié)果

2.1 三組肺組織肺損傷評分、W/D、LPI比較 與A組比較，B、C組肺損傷評分、W/D、LPI高(P<0．05);與B組比較，C組肺損傷評分、W/D及LPI低(P均<0．05),見表1。

表1 三組兔肺組織肺損傷評分

2.2 三組兔肺泡灌洗液TNFα、IL-1β、IL-6濃度比較 與A組比較，B、C組兔肺泡灌洗液TNFα、IL-1β、IL-6濃度升高 (P均<0．05)；與B組比較，C組兔肺泡灌洗液TNFα、IL-1β、IL-6濃度下降 (P均<0．05)，見表2。

表2 各組兔肺泡灌洗液TNFα、IL-1β、

2.3 三組各時點(diǎn)血漿細(xì)胞外組蛋白水平比較 與A組比較，B、C組各時間點(diǎn)血漿細(xì)胞外組蛋白水平升高(P均<0．05);與B組比較，C組各時間點(diǎn)血漿細(xì)胞外組蛋白水平降低(P均<0．05)，見表3。

表3 三組各時點(diǎn)血漿細(xì)胞外組蛋白水平

3 討論

單肺通氣期間細(xì)胞因子的相互激活和級聯(lián)反應(yīng)是引起急性肺損傷的主要機(jī)制之一。與肺部炎癥有關(guān)的炎癥因子為 TNFα、IL-1β，IL-6、IL-8 及細(xì)胞黏附分子，且受NF-κB的調(diào)控。TNFα 是介導(dǎo)急性肺損傷的主要細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)肺內(nèi)皮細(xì)胞活化、白細(xì)胞遷移、粒細(xì)胞脫顆粒和毛細(xì)血管滲漏。故本研究測定肺泡灌洗液中TNF-1α、IL-1β及IL-6的濃度判定肺組織炎性反應(yīng)程度。霧化吸入利用高速氧氣流形成液體霧，然后由呼吸道吸入以達(dá)到治療目的，具有用量少，起效快，不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，能有效治療呼吸道感染等疾病，因此本研究采用術(shù)前霧化吸入沙丁胺醇及布地奈德的給藥方式。本研究結(jié)果表明，與對照組相比其余各組肺損傷評分升高，肺組織W/D及LPI升高，且肺泡灌洗液中TNF-1α、IL-1β及IL-6濃度升高，提示長時間單肺通氣可導(dǎo)致肺組織水腫、通透性增加、炎癥反應(yīng)，提示單肺通氣致兔肺損傷模型制備成功。

沙丁胺醇是一種短效 β2腎上腺素能受體激動劑，與氣道平滑肌細(xì)胞膜上的 β-受體具有良好的親和力，經(jīng)氣道霧化吸入后形成直徑很小的氣溶膠顆粒，可達(dá)下呼吸道，藥物迅速彌散，直接作用于支氣管平滑肌，使平滑肌舒張，產(chǎn)生強(qiáng)大的支氣管擴(kuò)張作用，從而改善肺功能，減輕肺組織缺氧性損傷，進(jìn)而減輕缺氧引起的炎癥反應(yīng)[6]。研究[7]表明沙丁胺醇可減輕膿毒癥大鼠的肺炎癥反應(yīng)，改善肺功能。此外,沙丁胺醇還可以促進(jìn)黏膜纖毛擺動，增加纖毛清除功能，降低血管通透性，抑制炎癥滲出，改善肺功能。布地奈德是一種高效的局部抗炎糖皮質(zhì)激素，具有抗過敏、抗炎效果，其藥理作用是穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，抑制組胺釋放及支氣管收縮物質(zhì)的釋放，緩解平滑肌的收縮。布地奈德氣管內(nèi)治療可減輕鹽水灌洗模型導(dǎo)致的急性肺損傷，減輕炎癥反應(yīng)，抑制肺上皮細(xì)胞凋亡，改善肺功能[8]。研究[9]表明，術(shù)前霧化吸入布地奈德可抑制開胸手術(shù)患者單肺通氣時的炎性反應(yīng)，有助于改善肺功能。本研究結(jié)果表明，與B組相比，C組兔肺泡灌洗液TNF-1α、IL-1及IL-6的濃度下降，肺組織W/D及LPI下降，提示單肺通氣前吸入沙丁胺醇和布地奈德可減少TNF-1α、IL-1及IL-6等炎癥因子的釋放，從而減輕單肺通氣所致的肺組織炎癥反應(yīng)，減輕肺組織水腫。

組蛋白是一組高度保守、堿性、帶正電荷的蛋白質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞受到損傷或壞死時，染色質(zhì)發(fā)生降解，釋放核小體入外周血，核小體再分解為組蛋白和DNA，少量組蛋白可迅速被單核巨噬細(xì)胞清除。但在嚴(yán)重?fù)p傷情況下，死亡細(xì)胞釋放大量組蛋白，超過了機(jī)體的清除能力，過剩的細(xì)胞外組蛋白便會作為內(nèi)源性損傷相關(guān)分子啟動炎癥反應(yīng)導(dǎo)致進(jìn)一步的損傷[10，11]。研究[12]表明，細(xì)胞外組蛋白是急性肺損傷的重要效應(yīng)因子。研究[13，14]發(fā)現(xiàn)，小鼠在創(chuàng)傷、注射脂多糖后，血漿中細(xì)胞外組蛋白水平明顯升高，提示細(xì)胞外組蛋白可能是ARDS病程發(fā)展的重要炎癥介質(zhì)，由細(xì)胞外組蛋白引起的肺內(nèi)皮激活可導(dǎo)致ARDS患者的中性粒細(xì)胞活化。研究[15]表明，細(xì)胞外組蛋白可促進(jìn)塵肺患者肺纖維化。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，其余各組各時間點(diǎn)血漿細(xì)胞外組蛋白表達(dá)升高，提示細(xì)胞外組蛋白參與了單肺通氣兔肺組織炎癥反應(yīng)。有研究[16]表明，針對循環(huán)中組蛋白的治療可改善嚴(yán)重創(chuàng)傷后急性肺損傷患者的生存率。近期研究[17]表明，骨橋蛋白可減輕組蛋白引起的肺組織炎癥反應(yīng)，且肝素可減少ARDS患者中細(xì)胞外組蛋白的釋放，因此通過抑制細(xì)胞外組蛋白的釋放可減輕其誘發(fā)的肺炎癥反應(yīng)[18,19]。本研究結(jié)果顯示，與B組相比，C組各時間點(diǎn)血漿細(xì)胞外組蛋白水平下降，提示單肺通氣前吸入沙丁胺醇和布地奈德可通過降低血漿細(xì)胞外組蛋白水平而抑制肺組織炎癥反應(yīng)，減輕肺組織損傷程度。

綜上所述，預(yù)霧化吸入布地奈德復(fù)合沙丁胺醇對單肺通氣致兔肺損傷有預(yù)防作用，且可能是通過降低支氣管肺泡炎性因子及血漿細(xì)胞外組蛋白水平而起作用的，至于細(xì)胞外組蛋白降低是否與布地奈德復(fù)合沙丁胺醇對單肺通氣致兔肺損傷預(yù)防作用的機(jī)制有關(guān)有待進(jìn)一步研究探討。