張油兵，牛王翠，張洪銘，夏長(zhǎng)秀，李夢(mèng)媛，婁 偉，陳兆星，嚴(yán) 翔

（贛州市柑桔科學(xué)研究所，江西贛州 341000）

贛南臍橙園內(nèi)健康樹上掛有枯枝，而枯枝表層含有多種微生物，如果清理不及時(shí)，在病健交界處，枯枝上的致病菌勢(shì)必會(huì)通過農(nóng)事活動(dòng)、雨水、刮風(fēng)等感染健康枝，進(jìn)而影響樹的生長(zhǎng)勢(shì)。贛南地區(qū)近年來柑桔黑點(diǎn)病發(fā)生嚴(yán)重，據(jù)報(bào)道，在管理良好，枝干樹脂病不發(fā)生或發(fā)生很輕的果園，黑點(diǎn)病侵染來源主要來自枯死枝梢上的分生孢子[1]；炭疽病是嚴(yán)重危害農(nóng)作物生產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)運(yùn)的一大真菌性病害，具有危害廣和危害時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，主要侵害農(nóng)作物葉片、枝條、花、果實(shí)和果柄，常造成大量落葉、枝條枯死、落花、落果和果實(shí)腐爛[2]。本研究旨在從枯枝上分離出菌并進(jìn)行鑒定，及時(shí)了解不同季節(jié)枯枝上的病原菌，有針對(duì)性地進(jìn)行提前防治，減少柑桔的發(fā)病率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分離材料選取贛州市柑桔所內(nèi)臍橙果園的枯枝，采用PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)篩選菌株，其成分為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15g（1L）。

1.2 試驗(yàn)方法

采用五點(diǎn)取樣法，于4月份及8月份從果園內(nèi)采集枯枝，并立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理：剪取枯枝的一小段，置入含有滅菌水的培養(yǎng)皿中，浸泡清洗2～3min，吸取培養(yǎng)皿中的洗滌水30uL 到固體PDA 培養(yǎng)皿中，涂平板，之后放入28℃人工恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d，隨后用牙簽挑取培養(yǎng)皿中的單菌落至固體PDA 培養(yǎng)皿中，放入28℃人工恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d，觀察單菌落的外觀形態(tài)，并將樣品送到南昌科暢生物科技有限公司進(jìn)行鑒定菌的種屬關(guān)系，并進(jìn)行系統(tǒng)性的分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 外觀形態(tài)學(xué)觀察

圖1 4月份篩選的菌株

將分離到的菌株在PDA 培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線培養(yǎng)3d 后，從外觀形態(tài)進(jìn)行觀察（見圖版），篩選到的Ap1-1 和Au4-3在基質(zhì)上菌絲體呈現(xiàn)灰綠色，菌落灰色；Ap1-2和Au3-1 呈乳白色，翻開培養(yǎng)皿蓋子有股惡臭味，無菌絲體；Ap4-2 呈粉紅色，無菌絲體；Au1-1 菌絲體白色，菌落雪白，邊緣褶痕狀；Au4-4 菌落外觀呈黃色，無明顯菌絲體。

圖2 8月份篩選的菌株

圖3 Ap4-2進(jìn)化樹

圖4 Ap1-2進(jìn)化樹

圖5 Au4-4進(jìn)化樹

2.2 菌的種屬鑒定

將挑取的單菌落送到南昌科暢生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)定16SrDNA 序列，通過構(gòu)建進(jìn)化樹分析菌的種屬關(guān)系，針對(duì)細(xì)菌菌株Ap1-2、Ap4-2 和Au4-4進(jìn)行構(gòu)建進(jìn)化樹，如圖3～5 所示。

3 結(jié)論與討論

贛南臍橙園內(nèi)的枯枝表層含有的微生物群落依不同的季節(jié)、不同的生態(tài)環(huán)境，分布情況不一樣；本研究結(jié)果表明，4月份共篩選獲得3 株單菌株，分別為Ap1-1（枝狀枝孢菌）、Ap1-2（短小桿菌屬）和Ap4-2（甲基細(xì)菌），8月份篩選出4 株單菌株，分別為Au1-1（裂褶菌）、Au3-1（短小桿菌屬）、Au4-3（枝狀枝孢菌）和Au4-4（鞘氨醇單胞菌屬）；4月份和8月份均篩選出了枝狀枝孢菌和短小桿菌屬的菌株。

贛南地區(qū)一般在臍橙采摘完后，進(jìn)行果園的清理，往往這個(gè)時(shí)候，枯枝上的致病菌很可能已經(jīng)感染了健康的枝條或果面，及時(shí)了解不同季節(jié)枯枝上的病原菌，有針對(duì)性地進(jìn)行提前防治，以減少果園的打藥次數(shù)，減少發(fā)病率等，顯得尤為重要?？葜姆蛛x鑒定及防治研究能夠很好地為贛南柑橘產(chǎn)區(qū)從源頭上防治病害提供理論依據(jù)及技術(shù)支撐，對(duì)于穩(wěn)定柑桔產(chǎn)區(qū)的經(jīng)濟(jì)效益具有重大意義。