董一昕 李騰輝 劉燕 孫天石 張楚焌 黃翔 李衛(wèi)紅

〔摘要〕 目的 對(duì)比研究復(fù)合因素法與利血平皮下注射法所致脾氣虛證模型大鼠的臨床證候特征。方法 將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、復(fù)合因素組及利血平組，分別采用兩種方式造模后，通過一般體征指標(biāo)及證候量化評(píng)分評(píng)價(jià)臨床證候表現(xiàn);曠場實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠心理及自主活動(dòng);檢測血清D-木糖含量判斷消化吸收能力。結(jié)果 與正常組相比，兩模型組大鼠證候量化評(píng)分總積分及各單項(xiàng)均升高（P<0.05，P<0.001），且利血平組各個(gè)單項(xiàng)及總積分均高于復(fù)合因素組（P<0.05）;兩組大鼠自主活動(dòng)均較正常組減少（P<0.05）;與復(fù)合因素組相比，利血平組穿格次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、活動(dòng)距離下降尤為明顯（P<0.001）;與正常組相比，兩組大鼠血清D-木糖含量均下降（P<0.01），兩模型組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 兩種造模方式都可造成大鼠脾氣虛證候，但其臨床證候表現(xiàn)有所不同，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)結(jié)合需求進(jìn)行選擇。

〔關(guān)鍵詞〕 脾氣虛證;動(dòng)物模型;復(fù)合因素法;利血平

〔Abstract〕 Objective To compare the characteristics of clinical syndromes of spleen-Qi deficiency syndromes by compound factor method and reserpine subcutaneous injection method. Methods A total of 30 male SD rats were randomly divided into a normal group， a compound factor group， a reserpine group. After modeling by these two methods， general characteristics of rats and syndrome quantification score was carried out to assess clinical syndromes. Open-field test was operated to evaluate the psychological and autonomous activities of rats. Content of D-xylose in rat serum was detected to evaluate the digestion and absorption function. Results Compared with the normal group， individual and total scores of syndrome quantification in 2 model groups were increased （P<0.05， P<0.001）. The scores in the reserpine group were higher than the compound factor group （P<0.05）. The spontaneous activity of model rats were reduced than that of the normal group （P<0.05）. Compared with the compound factor group， the times of passing through the grille， the duration of staying at the central grille， and the movement distance were decreased significantly in reserpine group （P<0.001）. The serum D-xylose content of the model rats was significantly decreased than that of the normal group （P<0.01）， but there was no significant difference between the 2 model groups （P>0.05）. Conclusion? Both model methods can cause spleen deficiency syndrome in rats， but each has its own clinical syndromes， which could be selected according to experimental requirement.

〔Keywords〕 spleen-Qi deficiency syndrome; animal model; compound factor method; reserpine

脾氣虛證是臨床常見的中醫(yī)證候，以面黃食少、便溏或泄瀉、神疲乏力、少氣懶言、舌淡苔白、脈虛弱為臨床辨證要點(diǎn)。近年來對(duì)于脾氣虛證的現(xiàn)代病理生理學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行了很多研究，尤其是脾氣虛證動(dòng)物模型的制備在脾虛證的研究中占有重要作用。自從1979年北京師范大學(xué)張啟元教授[1]以“瀉下傷脾”的方式用大黃水煎液灌胃建立小鼠脾虛證模型以來，針對(duì)脾氣虛證造模方法的研究日趨豐富。目前常用的造模方法主要有三大類：一是單因素造模法，如中藥灌胃苦寒瀉下法、小平臺(tái)站立或力竭游泳等方法;二是多因素復(fù)合造模方法，常在飲食失節(jié)、過度勞倦、束縛應(yīng)激、苦寒瀉下等方式中選擇2～3種疊加處理造模[2];三為西藥理化因素造模，如皮下注射利血平法、秋水仙堿飼喂法、X射線照射法等[3]。這些方法都有各自的優(yōu)勢(shì)和弊端。本實(shí)驗(yàn)中從臨床證候表現(xiàn)及生化指標(biāo)方面對(duì)常用的“小承氣湯灌胃+力竭游泳+隔日斷食復(fù)合因素造模法”和“利血平皮下注射造模法”進(jìn)行了對(duì)比研究。

1 材料

1.1? 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（120±20）g，由北京市斯貝福生物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。

1.2? 藥物及試劑

利血平粉末（貨號(hào)：RH45599-1g，美國Bioruler公司），小承氣湯配方顆粒（組成：大黃12 g，枳實(shí)9 g，枳實(shí)9 g，厚樸6 g），每克復(fù)方配方顆粒含有6.7 g生藥，由北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院提供。冰醋酸（G73562B，上海泰坦化學(xué)有限公司）、D-（+）-木糖（RB10118，美國Bioruler公司）、D-木糖測試盒（A035， 南京建成生物工程研究所）。

2 方法

2.1? 動(dòng)物分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，將30只大鼠隨機(jī)分為3組：正常組、小承氣湯灌胃+力竭游泳+隔日斷食復(fù)合因素造模組（簡稱復(fù)合因素組）、利血平皮下注射造模組（簡稱利血平組），每組10只。

2.2? 兩種模型制備及正常組處理

復(fù)合因素組：采用小承氣湯灌胃、力竭游泳、隔日斷食3種復(fù)合因素造模。具體為：將小承氣湯配方顆粒配成0.35 g/mL的溶液，每日上午10：00給予灌胃，給藥劑量為5.25 g/（kg·d），每日下午14：00將動(dòng)物負(fù)載自身體質(zhì)量10%的重物，放入水深約50 cm、水溫20 ℃的水池中游泳至力竭（即鼻尖完全沒入水面以下5 s以上判斷為力竭狀態(tài)）;隔日上午撤去飼料，24 h后再添加飼料。

利血平組：采用利血平皮下注射進(jìn)行造模。以乙酸溶解利血平配成0.1 mg/mL的利血平乙酸溶液，生理鹽水稀釋后，每天按照0.5 mg/kg的劑量頸部皮下注射給藥。

正常組：不造模，每日以與復(fù)合因素組同等容量，用去離子水灌胃，并在頸部皮下注射與利血平組同等容量的生理鹽水，期間正常飲食飲水。

上述3組處理時(shí)間均為14 d。

2.3? 指標(biāo)檢測

2.3.1? 一般情況觀察? 造模期間觀察大鼠一般情況，如日常理毛、毛色、行為狀態(tài)、活躍程度、攝食、體質(zhì)量變化、大便次數(shù)與性狀等。

2.3.2? 癥狀量化積分? 利用文獻(xiàn)報(bào)道大鼠脾虛證候量化積分量表[4-5]（根據(jù)衛(wèi)生部《中藥治療脾虛證的臨床研究指導(dǎo)原則》[6-7]的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定），對(duì)模型大鼠癥狀進(jìn)行量化評(píng)分。見表1。

2.3.3? 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)? 造模結(jié)束后進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，在安靜的環(huán)境下將動(dòng)物放入曠場箱內(nèi)底面中心，底面區(qū)域被分割成25個(gè)4 cm×4 cm的方塊，在正上方2 m處架攝像頭同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)。觀察大鼠在場內(nèi)活動(dòng)情況，記錄并分析各組大鼠在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間百分比、曠場內(nèi)行走格數(shù)、站立次數(shù)、活動(dòng)距離等。

2.3.4? 血清D-木糖含量檢測? 行為學(xué)檢測結(jié)束后，將各組大鼠禁食不禁水飼養(yǎng)24 h，按照1 mg/0.1 kg的劑量灌服3%D-（+）-木糖水溶液，1 h后尾靜脈取血檢測D-木糖含量以評(píng)價(jià)消化道的吸收功能。

2.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)描述均以“x±s”表示，用ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較用SNK法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 一般情況觀察

造模期間正常組大鼠活動(dòng)正常、體格健壯、大便正常、背毛光澤緊密、無掉毛現(xiàn)象;兩模型組大鼠從造模第3天開始出現(xiàn)不同程度的扎堆無力、攝食量減少;在第1周結(jié)束時(shí)利血平組大鼠開始出現(xiàn)明顯肛周污穢癥狀，而復(fù)合因素組癥狀不明顯;兩周造模結(jié)束后，復(fù)合因素組大鼠消瘦乏力、反應(yīng)遲緩、大便稀軟、進(jìn)食量減少;利血平組癥狀更加明顯。見圖1。

3.2? 大鼠癥狀量化評(píng)分

各組大鼠體質(zhì)量變化，兩周內(nèi)正常組大鼠體質(zhì)量平穩(wěn)上升，而兩模型組從造模第3天開始體質(zhì)量就較正常組有所下降。造模第1周復(fù)合因素組大鼠體質(zhì)量增長速度較利血平組慢，從第2周開始利血平組大鼠消瘦情況明顯，體質(zhì)量增長速度減慢，從總體變化來看，兩模型組與正常組相比體質(zhì)量均出現(xiàn)明顯下降。見圖2。

根據(jù)量化積分表對(duì)動(dòng)物臨床證候表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如表2所示，與正常組相比，兩種模型大鼠的大便性狀、攝食量情況、體質(zhì)量增長率、精神狀況、皮毛情況積分均顯著升高（P<0.05、P<0.01、P<0.001），總積分也顯著高于正常組（P<0.001），說明兩種造模方法均誘導(dǎo)出了脾氣虛證的典型表現(xiàn)。兩模型組之間進(jìn)行比較，利血平組在各個(gè)單項(xiàng)及總積分均高于復(fù)合因素組，提示利血平誘導(dǎo)的脾氣虛證癥狀更為明顯。

3.3? 曠場實(shí)驗(yàn)

與正常組比較，兩模型組的各項(xiàng)指標(biāo)都有明顯變化，其中穿格次數(shù)、活動(dòng)距離、平均速度、站立次數(shù)均降低（P<0.05、P<0.01、P<0.001），復(fù)合因素組中央?yún)^(qū)停留時(shí)間顯著升高（P<0.01），利血平組，中央?yún)^(qū)停留時(shí)間減少（P<0.01）。兩模型組相比，利血平組穿格次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、活動(dòng)距離顯著小于復(fù)合因素組（P<0.001）。各組大鼠典型的運(yùn)動(dòng)軌跡如圖3所示，正常組大鼠活動(dòng)較多，活動(dòng)區(qū)域以角落和四周為主，兩組模型大鼠活動(dòng)明顯減少，尤其以利血平組變化更為顯著，甚至沒有形成閉合運(yùn)動(dòng)區(qū)域。復(fù)合因素組中心區(qū)域活動(dòng)次數(shù)明顯增多。見表3。

3.4? 血清D-木糖含量

D-木糖溶液灌胃1 h后，檢測血清D-木糖含量，可反映大鼠胃腸的吸收功能。造模后兩模型組大鼠血清D-木糖含量均下降，與正常組比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;而兩模型組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

4 討論

中醫(yī)學(xué)理論中的“脾”具有主運(yùn)化、統(tǒng)血、升清功能，藏意主思，為“氣血生化之源”，其生理功能應(yīng)包括現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中胃、脾、肝膽甚至大腦等臟器的部分生理功能。脾氣虛證是臨床最為常見的證候之一[4]，其病因多為先天稟賦不足、飲食不節(jié)、憂思勞倦過度等?，F(xiàn)代研究表明脾虛狀態(tài)下機(jī)體存在胃排空率、胃動(dòng)素等水平降低[8]，能量代謝下降[9]等多種病理改變。近年來對(duì)脾氣虛證的證候?qū)嵸|(zhì)以及健脾益氣中藥的藥理機(jī)制研究日趨豐富，因此建立理想的動(dòng)物模型尤為重要。

目前脾氣虛證的造模方法多種多樣，大概分為兩大類，一類為模擬中醫(yī)脾氣虛證的病因，單一或多因素疊加進(jìn)行造模，使動(dòng)物出現(xiàn)符合脾氣虛證的臨床特征，但多因素疊加造模操作規(guī)范性不強(qiáng)，模型穩(wěn)定性欠佳;另一類為西藥理化因素造模，多利用西藥不良反應(yīng)造成與中醫(yī)脾氣虛類似癥狀。以利血平為例，利血平屬于腎上腺能神經(jīng)阻斷劑，可耗竭動(dòng)物體內(nèi)去甲腎上腺素及5-羥色胺等的兒茶酚胺類遞質(zhì)，出現(xiàn)交感神經(jīng)功能下降，副交感神經(jīng)相對(duì)亢進(jìn)的現(xiàn)象，進(jìn)而表現(xiàn)出“脾氣虛”癥狀，但此造模方式是否能反映脾氣虛證實(shí)質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)選用多因素復(fù)合疊加及利血平注射兩種方式作為常用造模方式的代表，通過大鼠一般情況觀察、癥狀量化評(píng)分、行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、血清D-木糖含量等指標(biāo)，從臨床證候以及血清生化指標(biāo)角度進(jìn)行評(píng)價(jià)，為脾氣虛證的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

實(shí)驗(yàn)表明兩種模型動(dòng)物均出現(xiàn)了脾氣虛類似癥狀，癥狀量化評(píng)分較正常組有明顯升高。兩模型組比較，利血平組攝食量、大便性狀等各單項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分均高于復(fù)合因素組，且此組在造模后期便溏嚴(yán)重，理毛等自主行為次數(shù)明顯降低，皮毛雜亂并粘有較多污穢。

曠場實(shí)驗(yàn)通過大鼠在陌生空曠場地的反應(yīng)探究大鼠心理和自主活動(dòng)能力，是目前最常用的行為學(xué)監(jiān)測方法[10]。大鼠進(jìn)入新環(huán)境后的心理基本會(huì)經(jīng)歷緊張、興奮、探索、適應(yīng)等過程，其活動(dòng)既表現(xiàn)一定的趨避性，又具有對(duì)新事物的好奇性及探索性[11]，故大鼠前期在曠場內(nèi)因畏懼陌生環(huán)境多“貼墻”活動(dòng)，適應(yīng)后開始嘗試通過中心區(qū)域。其中運(yùn)動(dòng)平均速度和運(yùn)動(dòng)距離反映了動(dòng)物的活動(dòng)情況;中央?yún)^(qū)停留時(shí)間代表動(dòng)物啟動(dòng)活動(dòng)的潛伏時(shí)長，反映動(dòng)物對(duì)陌生環(huán)境的好奇程度;站立、理毛次數(shù)等說明動(dòng)物對(duì)周圍環(huán)境的滿意程度，當(dāng)動(dòng)物精神不佳或抑郁時(shí)其上述指標(biāo)會(huì)有所改變。脾氣虛證常出現(xiàn)倦怠乏力、注意力不集中等精神癥狀可通過曠場實(shí)驗(yàn)加以評(píng)測。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組大鼠在箱體內(nèi)活動(dòng)的區(qū)域主要以角落和四周為主，運(yùn)動(dòng)距離長，速度快，在中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間較短，后期垂直活動(dòng)較多;而兩模型組大鼠運(yùn)動(dòng)距離縮短，平均速度明顯降低，提示模型大鼠倦怠乏力癥狀明顯;站立次數(shù)下降，提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性降低;通過比較兩造模組運(yùn)動(dòng)距離和穿格次數(shù)，提示皮下注射利血平更容易導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)倦怠乏力的癥狀;復(fù)合因素組中央?yún)^(qū)停留時(shí)間明顯高于正常組，提示該組大鼠的好奇和探索性較強(qiáng)，而利血平組顯著低于正常組，反映了該組大鼠反應(yīng)淡漠，喜歡蜷縮趨避。

D-木糖是一種五碳糖，口服后以易化擴(kuò)散的形式在小腸中的空腸上段吸收[12]，不能被肝臟代謝，最終經(jīng)過腎臟排出，因而血清D-木糖含量的高低可以良好地反映機(jī)體消化吸收機(jī)能的變化，這一指標(biāo)經(jīng)常作為脾虛模型建立是否成功的參考[5]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示兩種模型大鼠的血清D-木糖含量均明顯降低，說明這兩種造模方法都可造成大鼠消化吸收功能下降。

綜上，兩種造模方式均可使模型動(dòng)物出現(xiàn)類似“脾氣虛”臨床表現(xiàn)，但復(fù)合因素造模法更符合中醫(yī)脾氣虛證的病因理論，而利血平組癥狀更為嚴(yán)重，尤其是神志功能的改變，利血平組更為明顯。而且在實(shí)驗(yàn)觀察中發(fā)現(xiàn)，造模結(jié)束后，復(fù)合因素組的大鼠在3～4周內(nèi)大部分癥狀都出現(xiàn)了不同程度的恢復(fù)，而利血平組自愈者較少，模型穩(wěn)定性相對(duì)較好?？偠灾瑐鹘y(tǒng)的基于中醫(yī)病因因素造模方法與利血平皮下注射的造模方式都可以造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)脾氣虛的證候，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)結(jié)合需求選擇更合適的造模方法，從而更好地促進(jìn)脾氣虛證的深入研究。

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