張運輝 周小青 伍大華 楊夢琳 鄭彩杏 童天昊 張祺杰

〔摘要〕 目的 探討二苯乙烯苷（tetrahydroxy stilbene glycoside， TSG）和遠志總皂苷（Tenuigenin， TEN）配伍對Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷的影響。方法 PC12細胞除空白組外運用Aβ25-35誘導建立阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease， AD）模型，被隨機分成模型組、TSG（200 mmol/L）組、TEN組（100 mg/L）、TSG-TEN配伍組（TSG200 mmol/L+TEN100 mg/L）、多奈哌齊組（10 ？滋mol/L）。采用MTT比色法檢測各組細胞存活率;取細胞上清液分別測各組的乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）含量及乙酰膽堿酯酶（AchE）、超氧化物歧化酶（SOD）活力;統計各組的細胞分化率。結果 （1）細胞存活率的高低為：TSG-TEN組>TSG組>多奈哌齊組>TEN組（P<0.01）;TSG組、TEN組、多奈哌齊組均低于TSG-TEN配伍組（P<0.01，P<0.05）;（2）與模型組比較，TSG組、TEN組、TSG-TEN配伍組可降低LDH含量、MDA含量、抑制AchE活力及增強SOD活力（P<0.05）。且TSG-TEN配伍組對降低LDH含量、MDA含量、抑制AchE活力及增強SOD活力效應比TSG或TEN單用組效應更好（P<0.01）;（3）PC12細胞的分化率高低為：TSG-TEN組>多奈哌齊組>TSG組>TEN組（P<0.01，P<0.05）;TSG組、TEN組、多奈哌齊組均低于TSG-TEN配伍組（P<0.01，P<0.05）。結論 TSG和TEN配伍對Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷具有顯著的協同保護作用，其作用機制可能與改善膽堿能系統、抗氧化應激、降低突觸可塑性損傷有關，且TSG優(yōu)于TEN。

〔關鍵詞〕 阿爾茨海默病;遠志總皂苷;二苯乙烯苷;突觸可塑性

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of tetrahydroxy stilbene glycoside （TSG） and tenuigenin （TEN） on the injury of PC12 cells induced by Aβ25-35. Methods PC12 cells were induced by Aβ25-35 to establish a PC12 cell model of Alzheimer's disease （AD）. After modeling， PC12 cells were randomly divided into a blank group， a model group， a TSG （200 mmol/L） group， a TEN group （100 mg/L）， a TSG-TEN compatibility group （TSG 200 mmol/L + TEN 100 mg/L） and a donepezil group （10 umol/L）.? MTT colorimetry was used to detect cell viability in each group; The lactate dehydrogenase （LDH） and malondialdehyde （MDA） content， acetylcholinesterase （AchE） and superoxide dismutase （SOD） activity in cell supernatant of each group were measured. The cell differentiation rate of each group was caculated. Results （1） The cell survival rate was TSG-TEN group﹥TSG group﹥donepezil group﹥TEN group （P<0.01）. Compared with the TSG-TEN combination group， the TSG group， the TEN group and the donepezil group were lower than the TSG-TEN compatibility group （P<0.01， P<0.05）. （2） Compared with the model group， TSG group， TEN group and TSG-TEN combination group could decrease LDH and MDA content， inhibit the activity of AchE， and increase SOD activity （P<0.05）， and the effect of TSG+TEN compatibility group on reducing the content of LDH and MDA， inhibiting the activity of AchE， and increasing SOD activity was better than that of TSG or TEN alone group （P<0.01）. （3） The differentiation of PC12 cells was： TSG-TEN group﹥donepezil group﹥TSG group﹥TEN group （P<0.01）. Compared with the TSG-TEN combination group， the TSG group， the TEN group and the donepezil group were lower than the TSG-TEN compatibility group （P<0.01）. Conclusion The combination of TSG and TEN has a synergistic protective effect on PC12 cell injury induced by Aβ25-35. The mechanism may be related to the improvement of cholinergic system， anti-oxidative stress and reducing synaptic plasticity damage， and TSG is superior to TEN.

〔Keywords〕 Alzheimer's disease; tenuigenin; tetrahydroxy stilbene glycoside; synaptic plasticity

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種老年人中最常見的中樞神經系統的退行性疾病，其主要以進行性記憶喪失和認知缺陷為臨床特征。近年來，許多學者研究證實，補腎化痰益智法對AD具有顯著的防治作用[1-2]，故提出補腎化痰益智法為治療AD的根本大法之一。補腎益智藥何首烏配伍化痰藥遠志是臨床上治療AD的常用藥對。研究已證明，何首烏的主要藥效物質二苯乙烯苷（tetrahydroxy stilbene glycoside， TSG）能通過增高膽堿乙酰基轉移酶乙酰/膽堿酯酶的比值、抗氧化應激、保護神經突觸的結構和功能等明顯提高擬AD動物模型學習記憶功能[3]。已有研究顯示，遠志的主要藥效物質遠志總皂苷（Tenuigenin， TEN）能顯著調控膽堿能系統和抑制氧化應激損傷[4]。研究團隊前期研究表明，TSG（200 mmol/L）和TEN（100 mg/L）分別是抑制AD損傷的主要有效劑量，且兩者配伍對神經細胞損傷有顯著的協同保護效應。因此，從膽堿能神經損害、氧化應激反應、突觸可塑性損傷三方面繼續(xù)探究TSG和TEN配伍對AD損傷的作用機制。

1 材料

1.1? 細胞

大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤細胞株PC12（永久性，高分化），購自湖南長沙贏潤生物技術有限公司，編號為2015032007。

1.2? 實驗試劑

TSG（北京北納創(chuàng)聯生物技術研究院，批號130725，質量分數98%）;TEN（北京北納創(chuàng)聯生物技術研究院，批號111572-200702，質量分數為98%）;Aβ25-35（美國Sigma公司）;鹽酸多奈哌齊片（中國衛(wèi)材藥業(yè)有限公司）;DMSO（Sigma公司）;FBS（吉泰遠成生物科技有限公司，批號1133067）;AchE（批號20140912）、SOD 試劑盒（批號20140911）、MTT（批號20140916）、MDA試劑盒（批號20140904）、LDH試劑盒（批號20140911）均來自于南京建成生物工程研究所;DMEM細胞培養(yǎng)液[賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司，批號NZL1253];10%新生小牛血清（Hyclone Lab）;PBS（北京索萊寶科技有限公司，批號20140605）等。

1.3? 主要儀器

DL-CJ-2NDI型超凈工作臺（中國北京東聯哈爾儀器制造有限公司）;Galaxy 170R型CO2培養(yǎng)箱（中國上海百賽生物技術有限公司）;UV1800ENG240V型紫外分光光度計（中國島津有限公司）;Primo Vert型倒置顯微鏡（Carl Zeiss Jena德國）;Eppendorf 5804R型低溫高速離心機（Eppendorf 5810R德國）。

2 方法

2.1? PC12細胞培養(yǎng)

用含5%馬血清和10%胎牛血清的DMEM，在95% O2、5% CO2、37 ℃條件下培育PC12細胞，每隔1天傳代1次，待PC12細胞增長至80%融合時，取0.25%胰酶消化細胞，隨后調整細胞數至1×106個/mL，接種或傳代于細胞培養(yǎng)板，取對數生長期細胞應用于實驗。

2.2? TSG和TEN配伍劑量的確定

本課題組前期研究表明，TSG（200 mmol/L）和TEN（100 mg/L）是抑制AD損傷的有效劑量，且兩者配伍對神經細胞損傷有明顯協同保護作用。故擬定200 mmol/L和100 mg/L分別為TSG和TEN抗AD細胞損傷的配伍劑量。

2.3? 分組及藥物干預

待細胞至對數生長期時，將上述方法“2.1”培養(yǎng)的PC12細胞，以2×105/mL密度，隨機接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔滴加100 μL細胞懸液，分為6個組，每組為8個孔。用20 μmol/L Aβ25-35誘導PC12細胞建AD模型[5]。24 h后6組分別進行不同的藥物干預：（1）空白組（正常的PC12細胞），（2）模型組（20 μmol/L Aβ25-35），（3）TSG組（20 μmol/L Aβ25-35+200 mmol/L TSG），（4）TEN組（20 μmol/L Aβ25-35+100 mg/L TEN），（5）TSG-TEN組（20 μmol/L Aβ25-35+200 mmol/L TSG+100 mg/LTEN）組，（6）多奈哌齊組（20? μmol/L Aβ25-35+10 μmol/L多奈哌齊）。均繼續(xù)培育24 h。

2.4? MTT比色法檢測各組的細胞存活率

將5×MTT稀釋成1×MTT溶液;每孔滴加50 μL 1×MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h;棄上清液，每個孔滴入200 μL DMSO，并在平板搖床上搖2～3 min使其充分混勻。使用酶標儀在570 nm波長處測各個孔的OD，計算PC12細胞的存活率。

2.5? 細胞分化率測定

將96孔培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡（10×40）下觀察，每個孔隨機選擇5個視野，每個視野記錄細胞總數與具有突起的細胞數量，算出各組細胞分化率并進行比較，觀察藥物對細胞突起的保護作用。細胞分化率的計算公式如下。

2.6? PC12細胞中LDH、MDA含量及AchE、SOD活力檢測

加藥培育24 h后，利用細胞刮徹底收集細胞，超聲破碎細胞后4 ℃下3 000 r/min離心10 min，收集細胞上清液并按照試劑盒方法測定細胞均漿中的LDH、MDA含量及AchE、SOD活力。

2.7? 統計學處理

實驗數據用“x±s”表示，用SPSS 17.0軟件進行統計分析，組間差異比較用單因素方差分析，方差齊者用LSD檢驗分析（方差不齊者先將數據轉換后使之方差齊），P<0.05說明差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 各組PC12細胞的細胞存活率和分化率比較

與空白組比較，模型組的PC12細胞的存活率明顯減低，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，TSG組、TEN組及TSG-TEN組PC12細胞的存活率均高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），并且細胞存活率的大小為：TSG-TEN組>TSG組>多奈哌齊組>TEN組（P<0.01）;與TSG-TEN組相比，TSG組、TEN組、多奈哌齊組均明顯低于TSG-TEN組（P<0.01，P<0.05）。見表1。

與空白組相比，模型組的細胞分化率明顯降低，差異顯著（P<0.01）;與模型組比較，各組PC12細胞的細胞分化率明顯增高，差異明顯（均P<0.05），TSG-TEN組及多奈哌齊組均增高明顯（P<0.01，P<0.05），且比TSG組和TEN單用組增高更顯著（P<0.01）。PC12細胞的細胞分化率高低為：TSG-TEN組>多奈哌齊組>TSG組>TEN組（P<0.01）。與TSG-TEN組相比，TSG組、TEN組、多奈哌齊組均明顯低于TSG-TEN配伍組（P<0.01）。見表1。

3.2? 檢測各組PC12細胞中LDH、MDA含量及AchE、SOD活力

與空白組比較，模型組LDH、MDA含量、AchE活力明顯升高，SOD活力明顯減低，（P<0.01，P<0.05）;與模型組相比，用藥組LDH、MDA含量，AchE活力顯著減低，SOD活力明顯增高（均P<0.05），且TSG-TEN組及多奈哌齊組對降低LDH和MDA含量、抑制AchE活力及增強SOD活力的效應比TSG或TEN單用組更好（P<0.01）。見表2。與TSG-TEN組比較，多奈哌齊組、TSG組、TEN組的LDH含量、MDA含量、AchE活力均高于TSG-TEN組，且SOD活力均明顯低于TSG-TEN組（P<0.01，P<0.05）。見表2。

4 討論

AD是一種主要以進行性認知功能障礙、精神行為障礙、日常生活能力障礙為主要表現的神經變性性疾病。大量的研究顯示，膽堿能系統損傷和氧化應激反應是導致AD產生的兩大重要機制。多項研究表明，乙酰膽堿（ACh）的缺失和乙酰膽堿酯酶（AchE）活性增高是AD膽堿能損傷的主要表現[6-7]。大量研究證實，丙二醛（MDA）含量增加、LDH漏出量增多、超氧化物歧化酶（SOD）活性減低是AD氧化應激反應的重要表現[8-9]。突觸可塑性能維持神經細胞和神經環(huán)路的穩(wěn)定性，與細胞改變緊密相關，在學習記憶中發(fā)揮極為重要的作用，同時也是神經系統疾病信號轉導的分子機制[10-11]。海馬神經細胞的突觸丟失和突觸可塑性改變在AD的早期病理過程中發(fā)揮極為重要的作用，在AD學習和認知功能障礙的發(fā)病機制中具有重要的地位[12]。因此，膽堿能神經損傷、氧化應激反應及突觸的可塑性損傷是導致AD發(fā)生發(fā)展的重要機制。

本研究主要是在補腎化痰益智法指導下，根據中藥方劑配伍理論，選擇臨床上常配伍使用的補腎藥何首烏和化痰藥遠志進行配伍，對補腎藥何首烏的有效成分TSG和化痰藥遠志的有效成分TEN進行配伍研究，用中藥有效組分配伍模式研究何首烏和遠志有效組分配伍治療AD的組方規(guī)律，尋找其治療AD的有效配伍組合，并從Aβ25-35所致AD模型PC12細胞的神經損傷及膽堿能系統、氧化應激反應、突觸可塑性損傷等方面探討TSG和TEN配伍組方抗AD的作用機制，從而形成一個組方簡單、成分清楚、作用明確、機制明了、質量可控、安全有效的新型中藥有效組分配伍組方。

多奈哌齊是第2代膽堿酯酶抑制劑，是全世界唯一一種同時被美國FDA和英國MCA批準上市對癥治療輕、中度AD的新藥。它分別在美國、日本和英國進行了Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期臨床研究驗證，目前已經在40多個國家和地區(qū)上市銷售。該藥對神經中樞AchE有顯著的選擇性，其治療作用是通過可逆性、選擇性地抑制AchE對Ach的水解而增加受體部位的乙酰膽堿含量，從而提高阿爾茨海默病患者的認知和記憶能力，卻很少出現外周的不良反應。多奈哌齊療效與他克林相似，卻有顯著的臨床安全性和很好的耐受性。所以本課究選用多奈哌齊作為陽性對照藥。

AchE是膽堿能系統神經細胞的標志酶之一，可催化Ach降解，其活性越高，Ach含量越低，兩者呈負相關。因此，降低AChE的活性能減少Ach降解，提高Ach含量，從而提高學習記憶能力。本實驗結果顯示TSG和TEN配伍組能顯著降低Aβ25-35誘導的PC12細胞的AChE的活性，并且比單用組效果更明顯，提示二者配伍能協同改善Aβ25-35誘導的PC12細胞的膽堿能系統損傷。自由基的產生會誘發(fā)脂質過氧化反應，所產生的脂質過氧化終產物MDA會導致AD的神經元凋亡。所以，MDA含量的高低能間接反映AD自由基的變化。SOD是機體內天然的氧自由基清除劑，是清除自由基酶系統中非常重要的酶類，故SOD活力的高低水平能間接反映機體清除氧自由基的能力。LDH是一種細胞內的糖酵解酶，廣泛分布于細胞漿內，LDH是細胞損傷的重要標志，當細胞受損或細胞膜通透性發(fā)生改變時，LDH會釋放至胞外，引起培養(yǎng)上清液中LDH活性增強，因此，細胞培養(yǎng)液中LDH 的活性可以客觀衡量細胞受損程度。本實驗結果顯示TSG和TEN配伍組能顯著降低Aβ25-35誘導的PC12細胞的MDA含量和LDH，明顯提高SOD活性，并且比單用組效果更明顯，提示二者配伍能協同抗Aβ25-35誘導的PC12細胞氧化應激損傷。神經細胞的突觸可塑性與學習記憶關系密切，其間接反映了整個神經系統回路的可塑性，是AD患者學習記憶漸進性損害并最終導致癡呆的直接原因。而細胞分化并長有突起是突觸可塑性的主要表現。本實驗結果顯示TSG和TEN配伍組能顯著提高Aβ25-35誘導的PC12細胞的細胞分化率，并且比單用組效果更明顯，提示二者配伍能協同改善Aβ25-35誘導的PC12細胞的突觸可塑性。本實驗結果顯示TSG和TEN配伍組能顯著改善Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷并具有明顯的協同作用，其作用機制可能與改善膽堿能系統損傷、抗氧化應激、改善突觸可塑性損傷有關，且TSG的作用優(yōu)于TEN。

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