路攀++++++米雪++++++苗勁蔚++++++吳迪

[摘要] 目的 采用子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜組織建立纖維化裸鼠模型。 方法 收集子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜組織（增殖期及分泌期），使用開腹方法將所取子宮內(nèi)膜組織種植入BALB/c裸鼠盆腹腔。觀察裸鼠子宮內(nèi)膜病灶生長以及裸鼠生存情況，分別于種植后的第7、14天開腹探查，觀察異位病灶的位置、大小及與周圍組織的關(guān)系，并取部分組織進(jìn)行病理驗(yàn)證。 結(jié)果 人子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型成功建立，裸鼠腹部表面可見隆起的結(jié)節(jié)，質(zhì)韌，與周圍組織粘連，活動(dòng)度差，開腹探查可見異位病灶大部分位于腹壁及膀胱旁，病理證實(shí)異位病灶可見子宮內(nèi)膜樣腺體結(jié)構(gòu)，周圍有基質(zhì)細(xì)胞及大量炎癥細(xì)胞浸潤，可見纖維組織沉積。 結(jié)論 子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜種植于裸鼠盆腹腔內(nèi)，可成功建立異體子宮內(nèi)膜異位癥纖維化裸鼠模型，為其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及其惡性生物學(xué)行為的研究提供平臺。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜異位癥；不孕；盆腔疼痛；盆腔包塊；動(dòng)物模型

[中圖分類號] R711.71 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（b）-0008-04

[Abstract] Objective To establish a fibrotic nude mouse model of human endometriosis by taking advantage of endometrial patients. Methods Stage proliferation and secretion of endometrial tissues in patients diagnosed as endometriosis were collected， thus a minilapamtomy was performed to transplant fresh human endometrial pieces into the peritoneum of BALB/c nude mice. The growth of endometrial disease lesion and survival situation in nude mice. The mice were killed at 7 and 14 d after transplantation to observe the location and size of the ectopic lesion and its relationship with the surrounding tissue. Part of the tissues were examined by histopathology. Results The human endometriosis model was successfully established， in which we could saw toughening lumps burged on the abdomen surface of nude mice， with the surrounding tissue adhesion， and mobility was poor. The most endometrial lesions located in nape and nexted to bladder were observed by through exploratory laparotomy. Pathology confirmed that endometrial glandular structure was surrounded by stromal cells and inflammatory cells infiltration， and it had fibrous tissue deposition in ectopic lesions. Conclusion A nude mouse model of endometriosis has been successfully established. It may provide an appropriate model for research of the mechanism of endometriosis.

[Key words] Endometriosis； Infertility； Pelvic pain； Pelvic cyst； Animal model

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是指子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)異位到宮腔以外的部分，以卵巢、子宮直腸陷凹、子宮骶韌帶等部位最常見，是婦科一種慢性的、良性的、雌激素依賴性的疾病，主要影響6%～10%的育齡期女性[1]，其病理學(xué)基礎(chǔ)為異位的子宮內(nèi)膜組織在雌激素的作用下周期性剝脫，這種異位內(nèi)膜周期性出血被其周圍組織包裹并發(fā)生纖維化，形成異位結(jié)節(jié)，占據(jù)正常卵巢組織并形成盆腔粘連[2]，從而導(dǎo)致慢性盆腔疼痛、不孕、月經(jīng)異常和痛經(jīng)等一系列癥狀，其中盆腔疼痛率高達(dá)45%～82%[3]，不孕率高達(dá)50%[4]，嚴(yán)重影響廣大女性的生活質(zhì)量。

然而EMs產(chǎn)生的具體機(jī)制尚不明確。目前有關(guān)EMs的機(jī)制主要有以下6種學(xué)說：異位種植學(xué)說、體腔上皮化生學(xué)說、誘導(dǎo)學(xué)說、遺傳因素、免疫與炎癥因素、其他因素，但均不能完全解釋EMs的發(fā)病、進(jìn)展及預(yù)后問題，而且就目前診治原則看來，手術(shù)及藥物治療雖有一定療效，但是復(fù)發(fā)率仍然較高[5-6]。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，術(shù)后1年的復(fù)發(fā)率為8%～10%，術(shù)后2年的復(fù)發(fā)率約20% [7]，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)36%～57%[8]。而且手術(shù)治療可造成有功能的卵巢組織減少，懷孕概率也明顯降低[9]；內(nèi)分泌藥物由于其嚴(yán)重的不良反應(yīng)而不能長期使用。EMs導(dǎo)致盆腔組織纖維化，是造成女性盆腔疼痛、不孕的主要原因，因此成功構(gòu)建出EMs的動(dòng)物模型，將從分子層面揭示EMs纖維化的機(jī)制，為將來發(fā)現(xiàn)更有效的診治方式提供很大幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇BALB/c雌性裸鼠20只[合格證號：scxk（京）2014-0004]，6～8周齡，體重17～21 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供無菌環(huán)境飼養(yǎng)（溫度22～24℃，濕度：45%～70%，12 h白天，12 h黑夜），分5籠飼養(yǎng)（每4只裸鼠放入1籠中），采用SPF級條件飼養(yǎng)。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循北京市所制訂的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南，并經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院（以下簡稱“我院”）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本來源

所用子宮內(nèi)膜均來自就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院因EMs行卵巢囊腫剔除術(shù)的5名患者，平均年齡為（35±4）歲，無生育要求，術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未經(jīng)任何激素治療，且均月經(jīng)周期規(guī)律，無子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病。行腹腔鏡手術(shù)切除卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫的同時(shí)，麻醉下采用診刮的方式獲得子宮內(nèi)膜（即嚴(yán)格消毒外陰、陰道及宮頸口，減少污染，刮取子宮內(nèi)膜1～2 g），刮出后立即放入含4 mL DMEM培養(yǎng)液無菌瓶中。同時(shí)留取部分內(nèi)膜組織用福爾馬林浸泡，所有病例術(shù)后病理提示為3名患者子宮內(nèi)膜為增殖期，2名患者子宮內(nèi)膜為分泌期。該研究方案經(jīng)過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并根據(jù)倫理學(xué)要求，所有患者均簽署相關(guān)知情同意書。

1.3 標(biāo)本處理

子宮內(nèi)膜組織離體后立即置入含4 mL DMEM培養(yǎng)液無菌瓶后，冰盒低溫運(yùn)輸，快速送于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行接種（接種時(shí)間應(yīng)在離體后1 h內(nèi)，否則影響接種成功率）。接種前標(biāo)本用冷的0.1 mol/L的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去血塊和黏液。沖洗至少三遍，然后于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)用無菌組織剪將沖洗好的子宮內(nèi)膜組織剪成2 mm×3 mm～3 mm×3 mm碎塊，每8～10小塊為一組，分別置入PBS中，準(zhǔn)備接種。

1.4 模型建立

裸鼠采用腹腔注射麻醉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的戊巴比妥15～18 ml/kg。麻醉后固定，取下腹正中橫切口長約1 cm，將上述處理的人子宮內(nèi)膜碎塊8～10塊隨機(jī)置入盆腹腔不同部位，采用無菌針縫合切口。每份子宮內(nèi)膜種植4只裸鼠（經(jīng)病理證實(shí)為增殖期的子宮內(nèi)膜組織種植于12只裸鼠盆腹腔，編號為1～12；分泌期子宮內(nèi)膜組織種植于8只裸鼠盆腹腔，編號為13～20），待裸鼠麻醉清醒后，置于溫度22～26℃，相對濕度50%～60%、無菌凈化屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)。當(dāng)日起給予裸鼠雌激素（苯甲酸雌二醇30 μg/kg，1次/3 d，腿部肌內(nèi)注射）。術(shù)后3 d，每日腹腔注射青霉素鈉100 μL/（只·次）（內(nèi)含200 000 U青霉素鈉）預(yù)防感染。根據(jù)文獻(xiàn)造模成功的標(biāo)志：肉眼可見種植呈隆起透明的結(jié)節(jié)狀、囊狀，移植物被結(jié)締組織覆蓋，并有血管形成，病理提示為子宮內(nèi)膜樣組織，見內(nèi)膜樣基質(zhì)和腺上皮結(jié)構(gòu)[10]。

1.5 觀察與取材

每日觀察裸鼠活動(dòng)情況及裸鼠腹部結(jié)節(jié)的變化，包括大小、位置、質(zhì)地、與腹壁的關(guān)系及與周圍組織的關(guān)系，并分別于種植后的第7、14天開腹探查，0.5%的戊巴比妥15～18 mL/kg麻醉下，采用下腹正中切口，大小約2 cm，打開裸鼠盆腹腔，觀察盆腹腔內(nèi)病灶的生長情況，包括位置、大小、數(shù)目及其與周圍臟器的關(guān)系、顏色、周圍血管生成情況，各自取材部分病灶標(biāo)本，分別放入10%福爾馬林溶液中浸泡，常規(guī)石蠟包埋，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組化，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 種植成功率

經(jīng)大體分析和病理分析，所有裸鼠模型均種植成功，即建模成功率為100%。

2.2 大體分析

種植后約7 d，部分移植內(nèi)膜可從裸鼠腹部肉眼可見，移植物有增大，可呈隆起的小包狀的透明結(jié)節(jié)或囊腫（圖1）。分別于種植后的第7、14天打開裸鼠的盆腹腔，觀察病灶，發(fā)現(xiàn)病灶以腹壁生長為主（55%），切口處常見，另膀胱旁（45%）、腸管附近（15%）可見小塊病灶。種植第7天可見移植內(nèi)膜與裸鼠組織牢固黏附，形成異位結(jié)節(jié)，質(zhì)韌，病灶邊緣血管生成明顯，裸鼠病灶與周圍組織輕度粘連，尚能分離（圖2）。種植第14天可見移植病灶變硬，與裸鼠組織連接致密，難以分離（圖2）。

2.3 顯微鏡下分析

在光鏡下可見子宮內(nèi)膜樣腺體增生，腺上皮細(xì)胞增生活躍，散在間質(zhì)細(xì)胞，類似于子宮內(nèi)膜樣腺上皮及基質(zhì)圍繞囊泡生長；腺體細(xì)胞呈立方形或扁平狀，腺體邊緣較多炎性細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）浸潤（圖3）。采用DAPI做熒光染料，在熒光顯微鏡下觀察免疫組化的結(jié)果，可見EMs內(nèi)膜組織中纖維化相關(guān)蛋白如CTGF、α-SMA、Collagen Ⅰ等表達(dá)明顯增加（圖4）。

3 討論

EMs是一種常見的婦科良性疾病，發(fā)病率逐年上升，主要影響生育期女性[11-13]。就目前而言，導(dǎo)致EMs患者盆腔疼痛和不孕的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，涉及免疫、激素、基因和環(huán)境等因素[14]，分子生物學(xué)專家認(rèn)為纖維化是導(dǎo)致盆腔疼痛及不孕的關(guān)鍵。與其他疾病一樣，對于EMs纖維化發(fā)生、發(fā)展的動(dòng)態(tài)研究以及探索有效的診斷策略，動(dòng)物模型是理想的研究對象。本實(shí)驗(yàn)采用裸鼠所建的人EMs模型中，病理顯示原有組織的形態(tài)及生化特征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果臨床觀察意義較大，可作為探索EMs纖維化的發(fā)病機(jī)制及有效診治策略的理想模型。

構(gòu)建EMs動(dòng)物模型的動(dòng)物選擇，現(xiàn)主要采用的動(dòng)物包括靈長類動(dòng)物、大鼠、裸鼠等[10，14-15]。但是靈長類動(dòng)物比較珍貴，且受到倫理學(xué)的限制而不能被用來科學(xué)研究[1]；大鼠、兔子有自身的免疫功能，可以經(jīng)過自體內(nèi)膜移植，但是其內(nèi)膜與人的內(nèi)膜在種屬及生化方面存在很大差異，因此此類動(dòng)物所見模型存在諸多局限[16-17]。然而因?yàn)槁闶髮儆诿庖呷毕菪∈?，不?huì)發(fā)生異種異體移植免疫排斥反應(yīng)，種植后成活率較高，模型構(gòu)建成功率較大，可重復(fù)性好，因此裸鼠模型比較常用。而且實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)裸鼠模型中成功生成的子宮內(nèi)膜異位病灶與人類的子宮內(nèi)膜異位病灶相似度高，可觀察性強(qiáng)，因此使用裸鼠是研究EMs的很好選擇。

目前EMs裸鼠模型的構(gòu)建方法主要有自體移植、皮下直接種植人類子宮內(nèi)膜組織法、皮內(nèi)注射EMs組織碎片法、腹腔內(nèi)直接種植人類子宮內(nèi)膜組織法、腹腔內(nèi)注射EMs細(xì)胞系法等[18-20]。由于裸鼠本身的子宮體積較小，取裸鼠的子宮內(nèi)膜需要嫻熟的實(shí)驗(yàn)技能及精確剝離子宮內(nèi)膜的方法，可操作性較差；而皮下種植不符合EMs的好發(fā)特點(diǎn)；子宮內(nèi)膜細(xì)胞系價(jià)格昂貴，種植入腹腔內(nèi)彌散性高易被吸收，而且用人的子宮內(nèi)膜可以使具有物種特異性的藥物被開發(fā)，從而利于人EMs的質(zhì)量。我們此次構(gòu)建EMs裸鼠模型即采用的是腹腔內(nèi)直接種植人子宮內(nèi)膜組織的方法，這樣更加符合EMs在人體中的發(fā)病特點(diǎn)，結(jié)果建模成功率為100%，并經(jīng)病理學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)證實(shí)。

但是實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，在腹腔種植子宮內(nèi)膜病灶存在一定的局限性：①不容易觀察，由于種植于腹腔，隨小腸的蠕動(dòng)，種植的病灶也會(huì)移動(dòng)，以至在觀察時(shí)不易定位。②不易測量，因?yàn)榉N植位置較深，雖然有部分的病灶會(huì)突出皮膚表面，可觀察到明顯的結(jié)節(jié)狀組織塊，但是其向腹腔內(nèi)延伸的大小不能明確，要測量其大小則需開腹，而裸鼠本身就免疫能力低下，容易感染，因此多次開腹可能影響裸鼠的存活能力，并增加感染機(jī)會(huì)；另外有部分種植的病灶明顯突向腹腔，表面無法觀察，不能確定模型種植是否成功，必須開腹探查。③給藥的問題，對于皮下或腹腔給藥無明顯不足，但是若病灶給藥則會(huì)出現(xiàn)問題，原因是對裸鼠表面結(jié)節(jié)塊不明顯的裸鼠，難以定位種植的病灶。

內(nèi)膜組織來源的選擇各有不同，采用正常的增殖期內(nèi)膜者，認(rèn)為增殖期的內(nèi)膜種植成功率較高；采用正常的分泌期內(nèi)膜者認(rèn)為分泌期內(nèi)膜種植更符合經(jīng)血逆流學(xué)說[21]。而本實(shí)驗(yàn)中所采取的內(nèi)膜組織既有增殖期內(nèi)膜又有分泌期內(nèi)膜，最終都種植成功，裸鼠體健且裸鼠表面均可見結(jié)節(jié)狀組織塊，質(zhì)韌，并通過病理切片證實(shí)為子宮內(nèi)膜組織。因此，在動(dòng)物模型的建立過程中，所采取的內(nèi)膜并無特殊要求。

從本次實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果來看，模型的建立比較成功，且最后經(jīng)病理證實(shí)為子宮內(nèi)膜組織，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)種植的子宮內(nèi)膜異位病灶與周圍組織明顯粘連，免疫組化證明與纖維化關(guān)系密切，因此該動(dòng)物模型可以用來研究纖維化在人EMs發(fā)生、發(fā)展及惡性生物學(xué)行為中的作用具有很大的臨床價(jià)值。

另外，因?yàn)樯鲜鎏岬礁骨环N植的問題，認(rèn)為裸鼠皮下種植效果可能更好：①好觀察，種植于皮下時(shí)，結(jié)節(jié)塊明顯，容易測量；②存活率高，種植于皮下避免了多次開腹，會(huì)減少出血量及縮短手術(shù)時(shí)間，降低感染率；③給藥方便，可以皮下給藥、腹腔給藥，必要時(shí)也可以病灶給藥。但是因?yàn)榫团R床研究看來，EMs患者的異位病灶多位于盆腹腔，裸鼠皮下種植的結(jié)果與腹腔內(nèi)種植的結(jié)果及臨床研究是否一致有待研究。

另外，臨床所見EMs以卵巢居多，那在建立EMs動(dòng)物模型時(shí)是否可以將病灶直接種植在裸鼠卵巢上呢？這樣是不是更加符合人EMs的發(fā)病情況呢？這一系列的問題有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Nyholt DR，Low SK，Anderson CA，et al. Genomewide association meta-analysis identifies new endometriosis risk loci [J]. Nature Genetics，2012，44（12）：1355-1359.

[2] De Ziegler D，Borghese B，Chapron C. Endometriosis and infertility：pathophysiology and management[J]. Lancet，2010，376（9742）：730-738.

[3] Mishra VV，Gaddagi RA，Aggarwal R，et al. Prevalence；characteristics and management of endometriosis amongst infertile women：a one year retrospective study [J]. Clin Diagn Res，2015，9（6）：QC01- QC03.

[4] De la Hera-Lazaro CM，Munoz-González JL，Perez RO，et al. Radical surgery for endometriosis：analysis of quality of life and surgical procedure [J]. Clin Med Insights Womens Health，2016，9：7-11.

[5] Hoo WL，Stavroulis A，Pateman K，et al. Does ovarian suspension following laparoscopic surgery for endometriosis reduce postoperative adhesions？ An RCT [J]. Hum Reprod，2014，29（4）：670-676.

[6] Young VJ，Ahmad SF，Brown JK，et al. Peritoneal VEGF-A expression is regulated by TGF-β1 through an ID1 pathway in women with endometriosis [J]. Sci Rep，2015，5：16859.

[7] Guo SW. Recurrence of endometriosis and its control [J]. Hum Reprod Update，2009，15（4）：441-464.

[8] Moscarini M，Milazzo GN，Assorgi C，et al. Ovarian stripping versus cystectomy：recurrence of endometriosis and pregnancy rate [J]. Arch Gynecol Obstet，2014，290（1）：163-167.

[9] Park H，Kim CH，Kim EY，et al. Effect of second-line surgery on in vitro fertilization outcome in infertile women with ovarian endometrioma recurrence after primary conservative surgery for moderate to severe endometriosis [J]. Obstet Gynecol Sci，2015，58（6）：481-486.

[10] Sillem M，Hahn U，Coddington CC，et al. Ectopic growth of endometrium depends on its structural integrity and proteolytic activity in the cynomolgus monkey（Macaca fascicularis）model of endometriosis [J]. Fertil Steril，1996，66（3）：468-473.

[11] 鄧姍，郎景和.左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)的臨床功用及相關(guān)基礎(chǔ)研究[J].國外醫(yī)學(xué)：婦產(chǎn)科學(xué)分冊，2004，5（10）：285-288.

[12] 章永平.腹腔鏡治療208例子宮內(nèi)膜異位癥患者的效果觀察[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2016，23（2）：68-70.

[13] 吳紅娟，劉廣珍，孔敏莉.子宮內(nèi)膜異位癥保守性手術(shù)聯(lián)合藥物鞏固后復(fù)發(fā)者應(yīng)用左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)的療效觀察[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2016，23（10）：105-106.

[14] Erten OU，Ensari TA，Dilbaz B，et al. Vitamin C is effective for the prevention and regression of endometriotic implants in an experimentally induced ratmodel of endometriosis. Taiwan [J]. Obstet Gynecol，2016，55（2）：251-257.

[15] Ding Y，Zhang M，Lang J，et al. In vivo study of endometriosis in mice by photoacoustic microscopy [J]. J Biophotonics，2015，8（1-2）：94-101.

[16] Bailey MT，Coe CL. Endometriosis is associated with an altered profile of intestinal microflora in female rhesus monkeys [J]. Hum Reprod，2002，17（7）：1704-1708.

[17] Berkley KJ，Dmitrieva N，Curtis KS，et al. Innervation of ectopic endometrium in a rat model of endometriosis [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（30）：11094-11098.

[18] Goktolga U，Cavkaytar S，Altinbas SK，et al. Effect of the non-specific matrix metalloproteinase inhibitor Doxycycline on endometriotic implants in an experimental rat mode [J]. Exp Ther Med，2015，9（5）：1813-1818.

[19] Matsuzaki S，Darcha C. Involvement of the Wnt/β-catenin signaling pathway in the cellular and molecular mechanisms of fibrosis in endometriosis [J]. PLoS One，2013，8（10）：e76808.

[20] Tamura K，Takashima H，F(xiàn)umoto K，et al. Possible role of α1-antitrypsin in endometriosis -like grafts from a mouse model of endometriosis [J]. Reprod Sci，2015，22（9）：1088-1097.

[21] 王丹波，張淑蘭，牛慧彥，等.人EMs裸鼠模型組織形態(tài)學(xué)變化及血管內(nèi)皮生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶9基因表達(dá)的研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2004，39（11）：759-762.