郭亞平，郭補林**，趙亞峰，劉旭琴，魯小慶，趙東艷，閆隱隱

(1.榆林市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 榆林 719000； 2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是指由多種原因引起的腎功能下降和腎實質損害、短期或長期不可逆轉的一類腎臟疾病，其病理表現為腎小球和腎間質內的炎癥反應導致的腎臟纖維化，故抑制炎癥反應對治療CKD具有重要意義[1]。有文獻報道，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activatedprotein kinase，p38 MAPK)信號通路參與了腎臟炎癥反應，其可將外界刺激轉導入細胞內，誘導產生腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和IL-8等多種炎癥因子，導致腎臟損害及腎纖維化，故阻斷p38 MAPKs信號通路對緩解CKD進展有重要的作用[2]。中醫(yī)藥在CKD等多種慢性疾病治療中有獨特的優(yōu)勢[3]。百令膠囊為人工合成的冬蟲夏草，是我國有名的滋補強壯中藥，研究已證實其對CKD患者的腎功能指標有一定的改善效果[4]。本研究采用自擬中藥湯劑聯合百令膠囊對CKD模型大鼠進行治療，探討這兩類中藥對CKD的治療機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 40只SPF級雄性SD大鼠，體質量(200±20)g，購自成都達碩生物科技有限公司[質量合格證號為SCXKC(111)2008-24]大鼠自由攝食飲水，適應性飼養(yǎng)1周。

1.1.2藥物與試劑 腺嘌呤(批號0183)購自美國 Amresco公司，百令膠囊(批號Z10910036)購自杭州中美華東制藥有限公司，生黃芪、茯苓、黨參、蒼術、炒白術、巴戟天、澤蘭葉、六月雪、紅花、桃仁、莪術、酒大黃和水蛭粉均購自成都杏林大藥房，大鼠Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)ELISA試劑盒(批號ZC-35983)和大鼠Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)ELISA試劑盒(批號ZC-36009)均購自上海茁彩科技有限公司，RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，SYBR Green Gene Expression Assay購自大連Takara公司，p-p38 MAPK多克隆抗體(批號44-684G)、p38 MAPK單克隆抗體(批號33-1300)、p-JNK單克隆抗體(批號PA1-9594)、JNK單克隆抗體(批號AHO1362)、p-ERK1/2單克隆抗體(批號MA5-15174)、ERK1/2單克隆抗體(批號MA5-15134)、IL-6多克隆抗體(批號ARC0062)、IL-8單克隆抗體(批號MA5-24081)、干擾素-γ(IFN-γ)單克隆抗體(批號ARC4033)和β-actin單克隆抗體(批號MA5-15739)均購自Thermo Fisher公司，HRP標記山羊抗兔、山羊抗鼠抗體均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1模型建立及給藥 將大鼠隨機分為空白組、CKD組、百令膠囊組和中藥湯劑聯合百令膠囊組4組，每組10只?？瞻捉M大鼠灌胃生理鹽水，其他組灌胃2.5%腺嘌呤混懸液(300 mg/kg)，連續(xù)4周，建立大鼠CKD模型。第5周，空白組和CKD組灌胃生理鹽水，百令膠囊組按0.625 g/kg劑量灌胃百令膠囊，中藥湯劑聯合百令膠囊組在百令膠囊基礎上加服中藥湯劑，根據大鼠和成人用藥計量換算系數6.25，計算得大鼠用中藥湯劑的劑量為20.94 g/kg。所有大鼠均按體質量每100 g給予1 mL劑量給藥，每天灌胃1次。自擬中藥湯劑制備方法：將生黃芪30 g，茯苓20 g，黨參、蒼術、炒白術、巴戟天、澤蘭葉各15 g，六月雪30 g、紅花、桃仁、莪術各12 g，酒大黃7 g，水蛭粉3 g，加入2 000 mL蒸餾水煎煮60 min，濃縮至96 mL，濃縮液中藥含量為2.09×103g/L。

1.2.2標本采集 末次給藥后大鼠置于代謝籠收集尿液樣本，并禁食24 h，按照30 mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉，麻醉后取腹主動脈血于抗凝采血管，靜置1 h后，于3 000 r/min離心10 min，收集血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采血結束后處死大鼠，摘取大鼠腎臟組織，生理鹽水清洗殘余血液后，將組織分為3部分，一部分置于4%多聚甲醛固定 24 h，制作HE病理切片；一部分腎臟組織置于液氮速凍后轉入-80 ℃保存保用；另一部分制備勻漿液，3 000 r/min離心10 min取上清液，-80 ℃保存。

1.2.3腎功能指標及Col-Ⅰ和Col-Ⅲ檢測 采用全自動生化儀檢測各組大鼠血清中血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)含量，檢測24 h尿白蛋白(UAlb/24 h)和尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(NAG)酶含量。采用ELISA試劑盒檢測腎組織勻漿液上清中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量。

1.2.4腎臟組織學觀察 腎臟組織固定24 h后進行脫水、透明、包埋和切片，HE染色后觀察各組大鼠腎臟組織組織學變化。

1.2.5腎組織中IL-6、IL-8和INF-γ mRNA的表達 使用總RNA提取試劑提取各組大鼠腎臟組織總RNA，并使用逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit合成cDNA，以cDNA樣品為模板，對IL-6、IL-8和INF-γ mRNA表達量進行檢測，引物由上海生工生物有限公司合成。IL-6引物：F端為5′-GAC TGA TGT TGT TGA CAG CCA CTG C -3′，R端為5′-AGC CAC TCC TTC T GT G AC TC T AAC T -3′。IL-8引物：F端為5′-TGG TCT CAG CCA CCCGC-3′，R端為5'-CCC TGT GGC TTG GCG G-3′。INF-γ引物：F端為5′-ATG AGT GCT ACA CGC CGC GTC TTG G-3′，R端為5′-GAG TTC ATT GAC AGC TTT GTG CTG G-3′。β-actin引物：F端為5′-GAC TGA TGT TG T TGA CAG CCA CT G C -3′，R端為5′-TAG CCA CTC CTT CTG TGA CTC TAA CT-3′。反應體系12.5 μL：SYBR Premix Ex TaqTMII 6 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板5 μL，ddH2O補足。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環(huán)。以β-actin為參照，用2-ΔΔCt法計算組織中各基因的相對表達量。

1.2.6腎組織中IL-6、IL-8、INF-γ、p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達 取100 mg腎組織剪碎后，根據蛋白提取試劑盒操作說明提取各組大鼠腎臟組織總蛋白，并用二喹啉甲酸(BCA)法進行定量。使用等量蛋白質上樣，蛋白變性后選擇10%SDS-PAGE進行分離，分離后的蛋白質轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(IL-6、IL-8、INF-γ、p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK1/2和p-ERK1/2和β-actin均按1 ∶400稀釋)，4 ℃孵育過夜后用TBST清洗3次，每次10 min，然后用相應二抗IgG(稀釋比例均為1 ∶5 000)室溫孵育1 h，再用TBST清洗3次，ECL暗室顯色。Bio-Rad全功能成像系統采集圖像后，用Image-ProPlus分析灰度值密度，以β-actin為內參，計算各組大鼠腎臟組織中相關蛋白的相對表達量，重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 血清BUN、Scr及UAlb/24 h及尿NAG酶

與空白組相比，CKD組大鼠血清中BUN、Scr含量、UAlb/24 h以及尿NAG酶明顯升高(P<0.01)，表明CKD模型復制成功；與CKD組比較，百令膠囊組和中藥湯劑聯合百令膠囊組大鼠上述指標均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與百令膠囊組相比，中藥湯劑聯合百令膠囊組BUN和Scr含量均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠腎功能相關指標Tab.1 Related indexes of renal function of rats in each

注：(1)與空白組比較，P<0.01;與CKD組比較，(2)P<0.01，(3)P<0.05；與百令膠囊組比較，(4)P<0.01，(5)P<0.05。

2.2 腎組織中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表達

與空白組相比，CKD組大鼠腎組織中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量增加，差異有統計學意義(P<0.01)；與CKD組相比，百令膠囊組和中藥湯劑聯合百令膠囊組大鼠腎組織中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。見圖1。

注：(1)與空白組比較，P<0.01;與CKD組比較，(2)P<0.01，(3)P<0.05；(4)與百令膠囊組比較，P<0.05。圖1 各組大鼠腎組織中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的表達Fig.1 The expression of Col-Ⅰ and Col-Ⅲ in renal tissue of rats in each group

2.3 腎組織學觀察

各組大鼠腎臟組織學結果顯示，對照組和百令膠囊組大鼠腎小管排列正常，腎小球結構完整；CKD組大鼠腎小球結構紊亂，腎小管壞死，囊性擴張，同時伴纖維增生及大量炎性細胞浸潤；與CKD組比較，百令膠囊組和中藥湯劑聯合百令膠囊組大鼠腎組織完整，腎小球數目增多，腎小管擴張程度降低，炎性細胞數量明顯減少，而中藥湯劑聯合百令膠囊組腎小管擴張程度、炎性細胞數量減少更明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠腎臟組織學變化(HE)Fig.2 Changes of renal histology of rats in each group(HE)

2.4 腎組織中炎性因子

CKD組大鼠腎組織中IL-6、IL-8和INF-γmRNA和蛋白表達量均顯著性上升，與空白組相比，差異有統計學意義(P<0.01)；與CKD組相比，百令膠囊組和中藥湯劑聯合百令膠囊組大鼠的IL-6、IL-8和INF-γmRNA和蛋白含量均降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；與百令膠囊組比較，中藥湯劑聯合百令膠囊組大鼠腎組織中IL-6、IL-8和INF-γmRNA和蛋白含量降低更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：A、B為 Western blot結果，C～E為Real-time PCR 結果；(1)與空白組比較，P<0.01;與CKD組比較，(2)P<0.01、(3)P<0.05；(4)與百令膠囊組比較，P<0.05。圖3 各組大鼠腎組織中IL-6、IL-8和INF-γ mRNA和蛋白表達Fig.3 The expression of IL-6, IL-8, INF-γ mRNA and protein expressions in renal tissue of rats in each group

2.5 腎組織中p-p38MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的表達

與空白組相比，CKD組大鼠腎組織中p-p38MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白均明顯升高(P<0.01)，而百令膠囊組大鼠腎組織中上述蛋白表達量均降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。與CKD組相比，中藥湯劑聯合百令膠囊組的p-p38 MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與百令膠囊組相比，中藥湯劑聯合百令膠囊組p-JNK蛋白表達明顯降低(P<0.05)，其余蛋白表達量也減少，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

3 討論

最新CKD流行病學調查資料顯示，我國CKD的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，對我國人民的生命健康造成了極大的危害，已是腎臟疾病領域的研究熱點[5]。雖然研究已證實腎組織的炎癥反應及其相關的組織損傷是導致其進展至終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的重要因素，但目前尚缺乏能有效抑制腎臟炎癥反應和改善腎組織損傷的藥物[6-7]。

中醫(yī)認為CKD病性為本虛標實和虛實夾雜，病機為人體腑臟功能失調、氣血虧損、陰陽失衡、脾腎虧虛、濁毒內蘊以及清濁不合等特點[8]。本研究采用自擬中藥湯劑聯合百令膠囊治療，方中生黃芪補氣升陽、益氣固表、利水消腫[9]，茯苓利水滲濕、健脾益胃，黨參和炒白術補中益氣、健脾益肺[10]，蒼術燥濕健脾，巴戟天溫腎壯陽、益精血、強筋骨、祛風濕，紅花、澤蘭葉、桃仁、莪術和水蛭粉均有活血化瘀、行水消腫的功效，配酒大黃活血泄?jié)?，六月雪疏風、清熱、利濕、舒筋活絡、解毒行淤，巧配巴戟天以溫腎祛濕，疏通經脈，化散瘀滯?，F代藥理學表明，生黃芪[11]、酒大黃[12]、蒼術[13]、莪術[14]具有調節(jié)免疫功能，黨參、巴戟天具有抗氧化、防衰老、抗炎、抗疲勞、增強記憶和抗腫瘤功能[15-16]。百令膠囊與天然冬蟲夏草藥理活性相似，主要成分包括D-甘露醇、麥角醇、蟲草酸、載體生物堿、多種氨基酸、維生素和微量元素等，在中醫(yī)理論上具有補益肺腎和止血化痰之功效[17]?，F代藥理學表明，百令膠囊具有免疫調節(jié)、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種藥理學活性，對腎臟、肺臟和肝臟均有保護效果[18]。研究發(fā)現，百令膠囊能改善CKD患者臨床癥狀、提高生活質量[19]。因此，本文聯合自擬中藥湯劑和百令膠囊對CKD大鼠進行干預，評價治療效果和可能機制。

注：(1)與空白組比較，P<0.01；與CKD組比較，(2)P<0.01、(3)P<0.05；(4)與百令膠囊組比較，P<0.05。圖4 各組大鼠腎組織中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表達Fig.4 The expression of p-p38 MAPK, p38 MAPK, p-JNK, JNK, p-ERK1/2 and ERK1/2 protein expression in renal tissue of rats in each group

Scr和BUN是反映腎功能損害的常規(guī)檢測指標。UAlb/24h與尿NAG酶被認為是早期腎損傷的主要標志物，而Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的過度沉積也是腎臟損傷的標志性病理特征[20]。本研究結果發(fā)現，CKD模型大鼠出現了典型的腎功能損傷癥狀，包括Scr、BUN、UAlb/24h、尿NAG、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量增加；經百令膠囊治療后，升高的上述腎損傷指標均被明顯抑制。同時，HE染色顯示，百令膠囊能改善CKD大鼠腎小球結構紊亂、腎小管壞死、腎小管間質纖維化和炎性細胞浸潤等病理變化，提示百令膠囊有保護腎臟的藥理學活性。用中藥湯劑聯合百令膠囊治療后，大鼠腎功能損傷指標被進一步降低，而腎臟組織病理學損傷也被進一步改善。表明中藥湯劑能增強百令膠囊對CKD大鼠的治療效果。Yang等[21]認為炎癥反應既是導致CKD的主要原因，又是CKD發(fā)生發(fā)展導致的結果。本研究進一步驗證了CKD中炎癥因子的變化及百令膠囊對炎癥因子的調控作用。結果表明，CKD模型大鼠腎組織中IL-6、IL-8和INF-γmRNA表達量顯著性增加，百令膠囊可顯著降低腎組織中IL-6、IL-8和INF-γmRNA的含量，而中藥湯劑能增強百令膠囊對促炎因子的抑制，提示中藥湯劑聯合百令膠囊能通過調節(jié)IL-6、IL-8和INF-γ等炎癥因子，從而減輕炎癥反應和腎臟損害。

腎組織炎癥反應的病理特征主要指腎組織炎性細胞浸潤、活化以及相關信號通路的激活。多條炎癥信號通路及細胞因子的活化參與了腎組織炎癥反應的調控，其中，p38MAPK作為重要的炎癥調控因子，其激活后進入細胞核調控多種轉錄因子的表達，從而促進炎癥細胞的浸潤與活化，加劇腎組織損傷[22]。研究發(fā)現，坎地沙坦和表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯通過p38-MAPK途徑改善慶大霉素誘導的大鼠腎臟損傷[23]。為了進一步探討百令膠囊抑制大鼠腎組織炎癥反應的可能作用機制，本研究檢測了p38 MAPK信號通路相關蛋白表達情況。研究結果表明，CKD模型大鼠腎組織中的p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2均明顯顯著增加，表明CKD模型大鼠腎組織中p38 MAPK信號通路被激活，百令膠囊能抑制大鼠p38 MAPK磷酸化蛋白(p-p38MAPK)及其下游的JNK和ERK通路的激活，但并無顯著性差異，而用中藥湯劑聯合百令膠囊干預后，激活的p38 MAPK信號通路被顯著性抑制。研究結果提示，模型鼠腎臟p38MAPK信號通路被激活后，p-p38MAPK進入細胞內，通過促進核內多種炎癥因子的表達，導致腎組織發(fā)生炎癥損傷。推測中藥湯劑聯合百令膠囊可通過下調p-p38MAPK的表達，從而改善CKD模型大鼠腎組織炎癥損傷。

綜上所述，中藥湯劑聯合百令膠囊可降低CKD大鼠BUN、Scr、UAlb/24 h、尿NAG酶、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量，改善腎臟組織病理變化和減輕炎癥損傷，其機制可能與抑制p38MAPK信號通路的激活有關。但中藥湯劑聯合百令膠囊調控p38MAPK信號通路，改善CKD大鼠腎損傷的上游通路還有待進一步研究。