方宗宇，馬莉，張智琪，吳青青**

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 檢驗中心，貴州 貴陽 550004)

BCR-ABL融合突變是由于染色體易位t(9;22)(q34;q11.2)導(dǎo)致費城染色體(philadelphia chromosome,Ph)的形成而產(chǎn)生, 是慢性髓系白血病的典型特征[1-2]，研究發(fā)現(xiàn)，20%～30%的成人急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)和 3%～5%的兒童ALL中可檢測到Ph染色體[3-7]。BCR-ABL融合突變導(dǎo)致酪氨酸激酶持續(xù)激活, 進而激活多種信號通路, 促進細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞分化和黏附等[8]。BCR-ABL由于含有持續(xù)的酪氨酸激酶活性, 因此含有BCR-ABL融合基因的患者對酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs) 敏感[9]。甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate，IM)是TKI的典型代表，作為BCR/ABL融合基因的靶向治療藥物，IM在Ph+ALL的治療中作為首選藥物可提高緩解率，但復(fù)發(fā)率高，易產(chǎn)生耐藥，并且對總生存率和長期無病生存率無明顯提高[10]。Ph+ALL對TKI耐藥機制復(fù)雜，報道較多的機理有耐藥相關(guān)基因如MDR和MRP等的高表達[11]、基因點突變[12]、BCR/ABL基因擴增[13]以及多條信號通路激活等[12]，是目前國內(nèi)外研究的熱點，但其具體機制仍未完全明確。因Ph+ALL中以Ph+B-ALL為主，本研究以Ph+B-ALL細(xì)胞系(SUP-B15)為對象，建立IM耐藥的Ph+B-ALL細(xì)胞系(SUP-B15/IM)，為尋找參與Ph+B-ALL的IM 耐藥的基因提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

親本細(xì)胞(SUP-B15)和IMDM培養(yǎng)基購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，伊馬替尼(sigma，美國)、胎牛血清(BI，以色列)、青鏈霉素(Hyclone，美國)、臺盼藍(lán)(Solarbio，北京)、PBS(Hyclone，美國)、培養(yǎng)瓶和離心管(Corning，美國)、Cell Counting Kit-8(同仁公司，日本)、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(BD，美國)、RNA提取試劑Trizol(Invitrogen，英國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB GreenTMPremix Ex TaqTMII試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1IM誘導(dǎo)SUP-B15/IM細(xì)胞系模型的建立 SUP-B15細(xì)胞在含有20%胎牛血清，含100 U/mL的青霉素和100 mg/L的鏈霉素的IMDM 培養(yǎng)基、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)Boichuk等[14]研究，用小劑量濃度遞增間歇誘導(dǎo)的方式加入IM誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥，由于初期加入藥物細(xì)胞極易死亡，因此第一次加藥濃度極低，為0.2 μmol/L[約為SUP-B15親本細(xì)胞1/80半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)值]。首先配置好完全培養(yǎng)基，加入一定量1 mmol/L IM儲備液配置成0.2 μmol/L工作液，再加入到細(xì)胞沉淀中，用吸管輕柔吹吸混勻后轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后再進行下一個藥物濃度的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)初期藥物濃度每次增加0.2 μmol/L，達到1 μmol/L濃度后、每次增加0.5 μmol/L，達到5 μmol/L濃度后、每次增加1 μmol/L，直到獲得了能在10 μmol/L IM條件下持續(xù)傳代的耐藥細(xì)胞SUP-B15/IM；對照組細(xì)胞SUP-B15/C除了不加藥物外，其傳代方法及次數(shù)同耐藥組。在驗證實驗使用之前，將SUP-B15/IM細(xì)胞維持在不含IM的培養(yǎng)基中，并傳代至少3次。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期的親本細(xì)胞(SUP-B15)、對照組細(xì)胞(SUP-B15/C)和耐藥組細(xì)胞(SUP-B15/IM)于倒置顯微鏡(100×)下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3細(xì)胞短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)鑒定 耐藥成功后，分別收集106個SUP-B15/C和SUP-B15/IM細(xì)胞，送至蘇州金唯智生物科技有限公司行STR鑒定。利用軟件對數(shù)據(jù)進行分析，并與相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫進行比較。

1.2.4細(xì)胞毒實驗及IC50測定 采用CCK8法分別檢測親本細(xì)胞(SUP-B15)、對照組細(xì)胞(SUP-B15/C)和耐藥組細(xì)胞(SUP-B15 /IM)對IM的敏感性。取各組對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞濃度為5×105個。實驗孔加入不同濃度的IM(20、40、60、80、100、120、140和160 μmol/L)，每個濃度設(shè)8個復(fù)孔；另外再設(shè)置不含IM的對照孔和不含細(xì)胞的空白孔，對照孔和實驗孔分別加入與IM相同體積的注射用生理鹽水，置于37 ℃ 5%CO2孵箱中孵育24 h后，在每孔中加入10 μL CCK8試劑，再置于孵箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值。8個復(fù)孔的數(shù)值去掉一個最高值和一個最低值，其余6孔吸光度值的平均值按下列公式計算抑制率，繪制生長曲線。抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%，其中Ac，As，Ab分別為對照孔、實驗孔及空白孔在450 nm波長處的吸光度值。用GraphPad Prism 5 軟件計算細(xì)胞IC50值，再根據(jù)IC50值計算出耐藥指數(shù)(resistance index，RI)。RI=耐藥細(xì)胞系的 IC50/對照細(xì)胞系的 IC50。

1.2.5細(xì)胞凋亡分析 用不同濃度(0、10和100 μmol/L)的IM處理細(xì)胞24 h后，使用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒檢測細(xì)胞存活和凋亡。分別收集SUP-B15/C和SUP-B15/IM細(xì)胞約5×105個，加入Binding Buffer 50 μL，再加入Annexin V-FITC 5 μL和Propidium lodide 5 μL混勻，室溫下避光孵育15 min；最后加入Binding Buffer 200 μL重懸上流式細(xì)胞儀檢測，并分析凋亡率。

1.2.6相關(guān)耐藥基因MDR1和MRP5 用不同濃度(0和100 μmol/L)的IM處理細(xì)胞24 h后分別收集106個對數(shù)生長期的SUP-B15/C和SUP-B15/IM細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并去除組織DNA；取cDNA 300 ng，使用RT-PCR法擴增MDR1和MRP5 mRNA。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)，最后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min。內(nèi)參基因β-actin上游引物5′-TGGCACCCAGCACA ATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′；MDR1上游引物5′-GAGAGATCCTCACCAAGCGG-3′，下游引物5′-CGAGCCTGGTAGTCAATGCT-3′；MRP5上游引物5′-GTCCTGGGTATAGAAGTGTG-3′，下游引物5′-CAGAAGATCCACACAACCCT-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)特征

采用光學(xué)顯微鏡觀察SUP-B15、SUP-B15/C和SUP-B15/IM細(xì)胞，結(jié)果顯示SUP-B15細(xì)胞為懸浮細(xì)胞、圓形、大小排列均勻、邊界清晰可見，具有典型淋巴細(xì)胞的特征(圖1A)；SUP-B15/C細(xì)胞在傳代過程中仍然保持典型淋巴細(xì)胞的特征(圖1B)，而耐藥的SUP-B15/IM細(xì)胞呈懸浮生長、細(xì)胞體積變小、邊界不清(圖1C)。

SUP-B15細(xì)胞 SUP-B15/C細(xì)胞 SUP-B15/IM細(xì)胞圖1 細(xì)胞形態(tài)比較(100×)Fig.1 Comparison of cellular morphology (100×)

2.2 SUP-B15 /C和SUP-B15 /IM細(xì)胞STR鑒定

STR鑒定結(jié)果顯示，經(jīng)過與數(shù)據(jù)庫進行比較，兩株細(xì)胞均與SUP-B15細(xì)胞遺傳位點吻合(圖2)。

注：C為SUP-B15/C細(xì)胞，R為SUP-B15/IM細(xì)胞。圖2 培養(yǎng)細(xì)胞的STR鑒定Fig.2 STR identification of cultured cells

2.3 3組細(xì)胞的IC50

通過CCK8法檢測SUP-B15、SUP-B15/C和SUP-B15/IM細(xì)胞對IM 的IC50，結(jié)果顯示：SUP-B15細(xì)胞對IM的IC50是16.72 μmol/L，SUP-B15/C細(xì)胞對IM的IC50是22.53 μmol/L，SUP-B15/IM細(xì)胞對IM的IC50是277.2 μmol/L，其中SUP-B15細(xì)胞與SUP-B15/C細(xì)胞的IC50比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；SUP-B15/IM細(xì)胞對SUP-B15/C細(xì)胞的RI為12.3。見圖3。

圖3 不同濃度IM作用后SUP-B15、SUP-B15/C和SUP-B15/IM細(xì)胞的存活率Fig.3 Survival rate of SUP-B15, SUP-B15/C and SUP-B15/IM cells after IM different concentrations

2.4 SUP-B15 /C和SUP-B15 /IM細(xì)胞凋亡分析

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，在IM濃度為0和10 μmol/L時SUP-B15/C細(xì)胞與SUP-B15/IM細(xì)胞的凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而在IM濃度100 μmol/L時SUP-B15/C細(xì)胞的凋亡率明顯高于SUP-B15/IM細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖4)。

注：A為SUP-B15/C細(xì)胞凋亡流式圖；B為 SUP-B15/IM細(xì)胞凋亡流式圖(10、100為加10和100 μmol/L IM)；C為凋亡率分析；(1)與SUP-B15/IM細(xì)胞比較，P<0.001。圖4 不同濃度IM下SUP-B15/C及SUP-B15/IM細(xì)胞凋亡Fig.4 SUP-B15/C and SUP-B15/IM apoptosis at different concentrations of IM

2.5 SUP-B15/C和SUP-B15/IM細(xì)胞中MDR1和MRP5的mRNA表達

100 μmol/L IM濃度下，SUP-B15/IM細(xì)胞中MDR1和MRP5 mRNA表達水平顯著高于SUP-B15/C細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖5)。

注：(1)與SUP-B15/C細(xì)胞比較，P<0.001。圖5 SUP-B15 /IM與SUP-B15/C細(xì)胞MDR1和MRP5 mRNA表達Fig.5 Expression of MDR1 and MRP5 mRNA in SUP-B15/IM and SUP-B15/C cells

3 討論

開發(fā)建立耐藥腫瘤細(xì)胞模型對于人類進行相關(guān)基礎(chǔ)研究和藥物的評價進而攻克腫瘤治療具有重大意義[14]。而在眾多建立耐藥模型的方法里，藥物濃度遞增法是最常用且有效的方法，所建立的耐藥細(xì)胞系具有耐藥性穩(wěn)定、可靠的特點，耐藥倍數(shù)普遍高于其他方式建立的耐藥細(xì)胞株[15]。另外目前尚缺乏Ph+B-ALL耐藥模型，建立穩(wěn)定有效的耐藥細(xì)胞株對Ph+B-ALL的研究尤為重要；因此，本研究采用藥物濃度遞增法建立的Ph+B-ALL耐藥細(xì)胞株可以為研究更深的耐藥機制提供模型，為攻克Ph+B-ALL臨床耐藥治療打下基石。

在本研究中，從Ph+B-ALL細(xì)胞系(SUP-B15)建立了對IM產(chǎn)生耐藥性的耐藥細(xì)胞系(SUP-B15/IM)。在誘導(dǎo)前期，細(xì)胞對IM極度敏感，因此起始階段加入的IM濃度極低，且增加IM濃度緩慢；在誘導(dǎo)3個月后，細(xì)胞生長速度有所增加，因此增加藥物濃度梯度變大，這可能是由于細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生了一定的耐藥性。值得注意的是，在誘導(dǎo)過程中，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了一些改變，例如細(xì)胞體積縮小，形態(tài)變得不規(guī)則，散在生長。

據(jù)統(tǒng)計約30%細(xì)胞系被交叉污染或錯誤辨識，在細(xì)胞的傳代過程 導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)偏移[16-17]。STR鑒定可以證實本研究的細(xì)胞是否被污染或錯誤辨識。本研究的細(xì)胞經(jīng)STR鑒定，表明通過12個月的誘導(dǎo)耐藥，細(xì)胞的短串聯(lián)重復(fù)序列沒有發(fā)生變化，說明細(xì)胞未出現(xiàn)問題。另外CCK8實驗表明，SUP-B15/IM細(xì)胞對SUP-B15/C細(xì)胞的耐藥指數(shù)為12.3，而SUP-B15細(xì)胞與SUP-B15/C細(xì)胞的IC50無明顯差異，說明耐藥組細(xì)胞確實產(chǎn)生了耐藥性。凋亡實驗也表明，濃度為100 μmol/L IM作用細(xì)胞24 h后，SUP-B15/IM細(xì)胞的凋亡率遠(yuǎn)低于SUP-B15/C細(xì)胞，同樣說明耐藥誘導(dǎo)成功。

MDR1是耐藥相關(guān)基因，它編碼P-糖蛋白(Pgp)，Pgp嵌于細(xì)胞膜表面形成具有外排功能的“泵”，能逆向轉(zhuǎn)運藥物排出細(xì)胞外，防止毒物在胞內(nèi)積聚對細(xì)胞造成損害[18]。有研究表明，MDR1基因的過度表達導(dǎo)致Pgp活性增加，從而降低IM對細(xì)胞的殺傷性[19-20]，另外研究證明，MRP5能夠轉(zhuǎn)運cGMP，也能將藥物排出胞外[21]。RT-PCR結(jié)果表明，在SUP-B15/IM細(xì)胞中用100 μmol/L IM作用細(xì)胞后MDR1和MRP5 mRNA表達水平顯著高于SUP-B15/C，意味著這兩個基因參與了SUP-B15/IM的耐藥過程。

總之，本研究建立了對IM具有高耐藥性的SUP-B15/IM系，為Ph+B-ALL患者耐藥機制研究提供了細(xì)胞模型。