張麗雷,徐夢(mèng)曉,張靜曉*,張文曦，唐文強(qiáng)

(1.洛陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471934；2.洛陽(yáng)師范學(xué)院食品與藥品學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471934；3.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 712046)

抑郁癥通常表現(xiàn)為情緒低落，睡眠質(zhì)量差，自尊心低下，以及失去對(duì)娛樂活動(dòng)的興趣，并且具有高度復(fù)發(fā)的可能性。有研究表明重度抑郁癥的遺傳性為37%至48%[1]，是嚴(yán)重影響人們正常生活的精神類疾病[2-4]。另外，抑郁癥是一種多因素疾病，主要與遺傳、生物學(xué)、環(huán)境和社會(huì)因素有關(guān)[5]。根據(jù)現(xiàn)代的心理學(xué)和生物學(xué)概念，抑郁癥不僅是精神障礙，而且也是生理疾病，具有明確的生物學(xué)基礎(chǔ)，例如重度抑郁癥病人會(huì)出現(xiàn)腦神經(jīng)損傷，神經(jīng)可塑性下降和神經(jīng)元回路異常等生理問(wèn)題[6]，需要使用藥物進(jìn)行治療。

氯胺酮是N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)的拮抗劑，由于能夠快速改善抑郁癥狀和降低自殺意念，作為新型的抗抑郁藥物受到了廣泛的關(guān)注[7-9]，但是由于具有致幻和濫用的風(fēng)險(xiǎn)限制了其臨床應(yīng)用。艾司氯胺酮是氯胺酮的對(duì)映異構(gòu)體，與NMDAR具有更強(qiáng)的結(jié)合力，并同樣具有改善抑郁癥狀和降低自殺意念的作用。然而，艾司氯胺酮抗抑郁的作用機(jī)制并不十分清楚，本文從艾司氯胺酮對(duì)NMDAR的拮抗機(jī)制出發(fā)，結(jié)合分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)方法研究艾司氯胺酮與NMDAR的作用機(jī)制，為闡明艾司氯胺酮的抗抑郁機(jī)制和新型抗抑郁藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

從蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(RCSB PDB)中獲取NMDAR的晶體結(jié)構(gòu)(3OEM)，去除N-甲基-D-天冬氨酸配體和結(jié)晶水，利用PDB2PQR軟件包[10]補(bǔ)全缺失的原子，記為NMDAR，作為NMDAR的初始結(jié)構(gòu)。從ATB數(shù)據(jù)庫(kù)[11]中獲取艾司氯胺酮的分子結(jié)構(gòu)和力場(chǎng)數(shù)據(jù)(Molid:204037)。采用AutoDock Vina程序[12]對(duì)艾司氯胺酮和NMDAR進(jìn)行對(duì)接，口袋大小設(shè)為20×20×20?3，網(wǎng)格間距設(shè)定為1.0?。

采用GROMACS(2018.4)軟件包[13]進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，將分子對(duì)接得到的艾司氯胺酮與NMDAR的復(fù)合物作為分子模擬的初始結(jié)構(gòu)，采用GROMOS 54A7力場(chǎng)。在初始結(jié)構(gòu)周圍延伸8?的立方體中填充水分子，建立周期性結(jié)構(gòu)，并加入2個(gè)氯離子使體系保持中性，最終整個(gè)體系大約包含60000個(gè)原子。首先對(duì)整個(gè)體系進(jìn)行1000步的能量極小化動(dòng)力學(xué)，再進(jìn)行100ps的限制性動(dòng)力學(xué)，使溶劑弛豫，之后再進(jìn)行20ns的NPT分子動(dòng)力學(xué)模擬。在模擬過(guò)程中，設(shè)置時(shí)間步長(zhǎng)2fs，運(yùn)用Velocity-rescale方法控制整個(gè)體系的溫度為310K，采用parrinello-rahman方法控制體系的壓力為1bar，使用PME方法計(jì)算長(zhǎng)程靜電相互作用，范德華截?cái)嘀翟O(shè)為12?。使用GROMACS軟件包對(duì)分子模擬的結(jié)果進(jìn)行分析，并采用VMD軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與討論

艾司氯胺酮與NMDAR蛋白對(duì)接的結(jié)果如圖1(a)所示，其中，艾司氯胺酮分子以球棍模型表示，NMDAR以蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)表示。從圖中可見，艾司氯胺酮分子成功對(duì)接于蛋白C端(CT)葉片和N端(NT)葉片中間的口袋位置?？疾炝税韭劝吠慕Y(jié)合引起的NMDAR結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)的變化，NMDAR對(duì)接前后模擬組合軌跡的主成分porcupine圖如圖1(b，c)所示，其中，箭頭表示在蛋白質(zhì)在第一振動(dòng)模式下骨架原子的運(yùn)動(dòng)方向。從圖中可見，對(duì)接之前的NMDAR蛋白的運(yùn)動(dòng)主要是C端和N端葉片結(jié)構(gòu)在逆時(shí)針方向上的有序運(yùn)動(dòng)，其中NT的運(yùn)動(dòng)振幅更大，C端振幅較小，運(yùn)動(dòng)更加無(wú)序。當(dāng)NMDAR與艾司氯胺酮對(duì)接之后，蛋白NT的運(yùn)動(dòng)改為順時(shí)針的運(yùn)動(dòng)，并且運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)減弱，也更加無(wú)序。這可能是由于艾司氯胺酮的對(duì)接減少了有序剛體葉片的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)程度，起到了穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的作用。

圖1 艾司氯胺酮與NMDAR對(duì)接后的結(jié)構(gòu)(a)，和NMDAR對(duì)接前(b)后(c)分子模擬運(yùn)動(dòng)的porcupine圖Fig.1 Docking configuration of s-ketamine with NMDAR,and porcupine diagrams of the NMDAR before (b) and after (c) docking

為了確定分子模擬過(guò)程中蛋白和配體的穩(wěn)定性，考察了模擬過(guò)程中蛋白和配體結(jié)構(gòu)的均方根偏差(RMSD)，結(jié)果如圖2所示。從圖中可見，經(jīng)過(guò)約3ns的模擬之后，NMDAR對(duì)接前后的結(jié)構(gòu)中蛋白和配體的RMSD值均趨于穩(wěn)定，上下波動(dòng)范圍穩(wěn)定在2?范圍之內(nèi)，表明所研究結(jié)構(gòu)在經(jīng)過(guò)平衡后均達(dá)到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。NMDAR對(duì)接前后結(jié)構(gòu)的RMSD沒有發(fā)生明顯的改變，表明艾司氯胺酮的對(duì)接對(duì)NMDAR的整體結(jié)構(gòu)影響不大。另外，模擬過(guò)程中艾司氯胺酮的RMSD值變化較小，表明艾司氯胺酮的結(jié)構(gòu)和位置沒有發(fā)生明顯的變化，結(jié)合穩(wěn)定。

圖2 NMDAR與艾司氯胺酮對(duì)接前后分子模擬過(guò)程中的RMSD圖Fig.2 RMSD of NMDAR before and after docking withs-ketamineduring molecular simulation

圖3 NMDAR與艾司氯胺酮對(duì)接前后結(jié)構(gòu)分子模擬過(guò)程中的RMSF圖Fig.3 RMSF of NMDAR before and after docking with s-ketamine during molecular simulation

蛋白殘基的均方根波動(dòng)值(RMSF)是衡量殘基在整個(gè)運(yùn)動(dòng)軌跡中相對(duì)于平均位置的波動(dòng)程度。為了考察艾司氯胺酮的結(jié)合對(duì)NMDAR功能區(qū)域的影響，對(duì)NMDAR在結(jié)合前后分子模擬過(guò)程中各個(gè)殘基的RMSF進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3所示。從圖中可見，在艾司氯胺酮的結(jié)合之后，部分殘基的RMSF值發(fā)生了明顯的變化。其中，TRP238、THR56、GLY190、LYS239、LYS191、ARG237等殘基的RMSF變化較大，表明艾司氯胺酮的結(jié)合可能主要影響與這些殘基相關(guān)區(qū)域的功能，從而調(diào)節(jié)NMDAR的活性。

通過(guò)考察蛋白的溶劑可及表面積可以考察蛋白的親水和疏水性?？疾炝薔MDAR在與艾司氯胺酮對(duì)接前后的結(jié)構(gòu)在分子模擬過(guò)程中溶劑可及表面積的變化，結(jié)果如圖4所示。從圖中可見，蛋白的溶劑可及表面積可分為親水性表面積和疏水性表面積，NMDAR在與艾司氯胺酮對(duì)接之后，總的溶劑可及表面積有所減小，其中，疏水性表面積幾乎無(wú)變化，而親水性表面積減小，表明NMDAR在與艾司氯胺酮對(duì)接之后，蛋白的親水性減小，這可能是艾司氯胺酮能夠抑制NMDAR活性的原因之一。

圖4 NMDAR與艾司氯胺酮對(duì)接前后分子模擬的溶劑可及表面積Fig.4 Solvent accessible surface of NMDAR before and after docking with s-ketamine during molecular simulation

圖5 NMDAR與艾司氯胺酮對(duì)接前后分子模擬過(guò)程中蛋白內(nèi)部的氫鍵數(shù)目Fig.5 Hydrogen bonds number inside NMDAR before and after docking with s-ketamine during molecular simulation

蛋白內(nèi)部的氫鍵是影響蛋白穩(wěn)定性的主要原因之一。為了考察艾司氯胺酮對(duì)NMDAR穩(wěn)定性影響的原因，分析了MBDAR在與艾司氯胺酮對(duì)接前后蛋白內(nèi)部氫鍵數(shù)目的變化，結(jié)果如圖5所示。從圖中可見，在與艾司氯胺酮對(duì)接之前，MBDAR內(nèi)部的氫鍵數(shù)目在190個(gè)左右，在分子模擬的過(guò)程中變化不大，維持在170個(gè)至210個(gè)之間。在與艾司氯胺酮對(duì)接之后，MBDAR內(nèi)部的氫鍵數(shù)目有所增加，并且在模擬的過(guò)程較為穩(wěn)定，維持在180個(gè)至215個(gè)之間，表明MBDAR在與艾司氯胺酮對(duì)接之后蛋白內(nèi)部氫鍵數(shù)目的增加可能是蛋白穩(wěn)定的原因。

3 結(jié)論

采用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)方法研究了艾司氯胺酮與NMDAR之間的分子作用機(jī)制，結(jié)果表明，艾司氯胺酮趨向結(jié)合于NMDAR的口袋部位，使蛋白N端的運(yùn)動(dòng)方式從有序的順時(shí)針運(yùn)動(dòng)改變?yōu)闊o(wú)序的運(yùn)動(dòng)，并使運(yùn)動(dòng)振幅減弱。經(jīng)過(guò)分子模擬獲取了NMDAR與艾司氯胺酮結(jié)合的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)艾司氯胺酮主要影響蛋白的TRP238、THR56、GLY190等殘基部位。通過(guò)蛋白的溶劑可及表面積和蛋白內(nèi)部氫鍵數(shù)目分析表明，艾司氯胺酮的結(jié)合使NMDAR的親水性減小，疏水性增加，蛋白內(nèi)部氫鍵數(shù)目增加，這可能是艾司氯胺酮調(diào)節(jié)NMDAR結(jié)構(gòu)活性的主要因素，本文的研究為闡明艾司氯胺酮的抗抑郁機(jī)制和新型抗抑郁藥物的開發(fā)提供了理論依據(jù)。