陳 劍，吳月嫻，呂 寒，簡暾昱，丁曉琴，李佳偉，劉 艷，任冰如

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)江蘇省抗糖尿病藥物篩選技術(shù)服務(wù)中心，江蘇 南京 210014〕

糖尿病屬于多病因的代謝性疾病，顯著臨床特征為慢性高血糖，并常伴有糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。隨著患病時間延長，若病人體內(nèi)代謝紊亂得不到很好地控制，容易產(chǎn)生心腦血管疾病、腎功能衰竭、肢體壞疽和昏迷等并發(fā)癥[1]。中草藥在治療糖尿病上具有獨特療效[2]，從中草藥資源中尋找治療糖尿病及其并發(fā)癥的天然產(chǎn)物已成為研究熱點[2]。

枇杷〔Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.〕干燥葉為常用中藥材，具有清肺止咳和降逆止嘔等作用，主要用于治療呼吸系統(tǒng)疾病[3]。近年來，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)枇杷葉富含三萜酸類、黃酮類及倍半萜苷類等活性成分[4-8]，具有顯著的降血糖作用[9]。鑒于此，作者對枇杷葉中6個三萜酸類成分在體外抑制與糖尿病及其并發(fā)癥相關(guān)的α-葡萄糖苷酶活性和非酶糖化反應(yīng)產(chǎn)物(Amadori和AGEs)形成的能力進行了研究，以期為應(yīng)用枇杷葉治療糖尿病及其并發(fā)癥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的6個三萜酸類成分(包括薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸)均為前期從枇杷葉中分離獲得[8]，純度在95%以上。

主要試劑：α-葡萄糖苷酶和牛血清白蛋白(BSA)購自美國Sigma-Aldrich公司；對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化硝基四氮唑藍(NBT)購自上海恒星應(yīng)用化學(xué)研究所；阿卡波糖購自德國Bayer公司；葡萄糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%疊氮化鈉、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉均為分析純，購自國藥集團上海化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器有Mettler EL204電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)、MD SpectraMax Plus 384酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)、Thermo Finnpipette精密單通道加樣器(美國Thermo Fisher公司)和Vortex-5旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液制備 精密稱取薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸各5.0 mg，先用無水乙醇定容至5.0 mL，配制成質(zhì)量濃度1.0 mg·mL-1母液，再逐級稀釋成質(zhì)量濃度50、20和10 μg·mL-1樣品溶液。

1.2.2 對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率測定 參照左袁袁等[10]的方法測定。在96孔板中依次加入2 μLα-葡萄糖苷酶液和78 μL 67 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)，37 ℃水浴孵育10 min；向溶液中加入20 μL pNPG，37 ℃水浴孵育10 min；使用酶標(biāo)儀在波長405 nm條件下測定反應(yīng)液的吸光度(A0)。采用等體積磷酸鹽緩沖液代替α-葡萄糖苷酶液，按照上述操作測定反應(yīng)液的吸光度(A0′)。

按照上述操作在96孔板中依次加入2 μLα-葡萄糖苷酶液、77 μL磷酸鹽緩沖液和1 μL樣品溶液，相同條件下測定反應(yīng)液的吸光度(A1)。采用等體積磷酸鹽緩沖液代替α-葡萄糖苷酶液，按照上述操作測定反應(yīng)液的吸光度(A1′)。以阿卡波糖為陽性對照，每個樣品溶液重復(fù)測定3次。α-葡萄糖苷酶活性抑制率(IR)根據(jù)公式“IR=〔(A0-A0′)-(A1-A1′)〕/(A0-A0′)×100%”計算，據(jù)此計算供試樣品和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度(IC50)。

1.2.3 對非酶糖化反應(yīng)產(chǎn)物的抑制率測定

1.2.3.1 非酶糖化反應(yīng)體系的建立 參照文獻[11]中的方法，將葡萄糖和BSA先用濃度0.1 mol·L-1PBS緩沖液(pH 7.4)溶解，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%疊氮化鈉和不同濃度樣品溶液，使葡萄糖終濃度為500 mmol·L-1，BSA終濃度為40 g·L-1；搖勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育15 d。設(shè)置4個對照組，分別為A(加葡萄糖和BSA)、B(只加BSA)、C(加樣品和葡萄糖)和D(加樣品和BSA)。

1.2.3.2 對Amadori形成的抑制率測定 取上述各組反應(yīng)溶液50 μL，加入2.0 mL 0.1g·L-1NBT溶液，渦旋混勻，37 ℃水浴孵育15 min；向溶液中加入0.1 mL體積分?jǐn)?shù)15%乙酸溶液，并置于冰水浴中終止反應(yīng)；吸取150 μL溶液，在波長530 nm條件下測定反應(yīng)液的吸光度(A)。每個樣品溶液重復(fù)測定3次。供試樣品對Amadori形成的抑制率(IR1)根據(jù)公式“IR1=〔1-(A樣品-AC-AD)/(AA-AB)〕×100%”計算。

1.2.3.3 對AGEs形成的抑制率測定 采取上述方法構(gòu)建反應(yīng)體系，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育60 d；采用酶標(biāo)儀分別在激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長440 nm、狹縫寬度1 nm條件下測定反應(yīng)液的熒光值(F)。每個樣品溶液重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值。供試樣品對AGEs形成的抑制率(IR2)根據(jù)公式“IR2=〔1-(F樣品-FC-FD)/(FA-FB)〕×100%”計算。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行多重比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

枇杷葉中不同三萜酸類成分對α-葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度(IC50)見表1。由表1可見：枇杷葉中供試的6個三萜酸類成分對α-葡萄糖苷酶活性均有較強的抑制作用，且對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力顯著(P<0.05)高于阿卡波糖。各三萜酸類成分對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力差異顯著。其中，熊果酸對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力最強，IC50值僅0.76 μg·mL-1；接下來依次為科羅索酸、齊墩果酸、馬斯里酸、委陵菜酸、薔薇酸，IC50值分別為1.14、1.27、1.86、10.68、35.45 μg·mL-1。

三萜酸類成分Triterpene acidsIC50/(μg·mL-1)薔薇酸Euscaphic acid35.45±0.02b委陵菜酸Tormentic acid10.68±0.03c科羅索酸Corosolic acid1.14±0.01f馬斯里酸Maslinic acid1.86±0.01d齊墩果酸Oleanolic acid1.27±0.01e熊果酸Ursolic acid0.76±0.01g阿卡波糖Acarbose 569.23±5.02a

1)同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercases in the same column indicate the significant(P<0.05)difference.

2.2 對非酶糖化反應(yīng)產(chǎn)物的抑制作用

不同質(zhì)量濃度枇杷葉中三萜酸類成分對Amadori形成的抑制率見表2。由表2可見：枇杷葉中供試的6個三萜酸類成分均可抑制非酶糖化反應(yīng)早期產(chǎn)物Amadori的形成，且抑制作用隨著質(zhì)量濃度降低而顯著下降。在不同質(zhì)量濃度條件下，6個三萜酸類成分表現(xiàn)為薔薇酸對Amadori形成的抑制率最高，科羅索酸次之，委陵菜酸和馬斯里酸居中，熊果酸較低，齊墩果酸最低。尤其在50 μg·mL-1條件下，薔薇酸、科羅索酸、委陵菜酸和馬斯里酸對Amadori形成的抑制率均在65%以上。

然而，這6個三萜酸類成分對非酶糖化反應(yīng)終產(chǎn)物AGEs形成的抑制作用卻較弱(數(shù)據(jù)表略)，在抑制能力最強的50 μg·mL-1條件下，薔薇酸、委陵菜酸、科羅索酸、馬斯里酸、齊墩果酸和熊果酸對AGEs形成的抑制率僅分別為18.71%、10.13%、12.43%、9.32%、2.13%和7.14%。

三萜酸類成分Triterpene acids不同質(zhì)量濃度下的抑制率/%Inhibition rate under different mass concentrations50 μg·mL-120 μg·mL-110 μg·mL-1薔薇酸Euscaphic acid83.63±2.60aA64.68±3.75aB32.45±3.53aC委陵菜酸Tormentic acid65.69±3.86bA46.74±4.86bB14.67±3.09bC科羅索酸Corosolic acid70.29±7.59bA56.57±4.80aB25.85±5.85aC馬斯里酸Maslinic acid65.57±5.13bA42.57±7.43bB16.57±6.74bC齊墩果酸Oleanolic acid35.29±3.21dA20.57±4.65cB7.46±2.64cC熊果酸Ursolic acid51.20±6.03cA38.49±5.01bB11.46±4.60bC

1)同列中不同小寫字母表示在同一質(zhì)量濃度不同三萜酸類成分間差異顯著(P<0.05)Different lowercases in the same column indicate the significant(P<0.05)difference among different triterpene acids with the same mass concentration；同行中不同大寫字母表示在同一三萜酸類成分不同質(zhì)量濃度間差異顯著(P<0.05)Different uppercases in the same row indicate the significant(P<0.05)difference among different mass concentrations of the same triterpene acids.

3 討 論

競爭性抑制小腸黏膜刷狀緣內(nèi)的α-葡萄糖苷酶活性可使糖尿病人餐后的血糖峰值漸變低平、波動減小[12]。本研究中，枇杷葉中6個三萜酸類成分對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用顯著強于阿卡波糖，說明枇杷葉中的三萜酸類成分具有降低糖尿病患者餐后血糖的潛在活性。

AGEs大量產(chǎn)生是造成糖尿病人出現(xiàn)動脈粥樣硬化、微血管病變、視網(wǎng)膜病和糖尿病性腎病等并發(fā)癥的重要原因。非酶糖化反應(yīng)抑制劑可阻止AGEs形成，是預(yù)防糖尿病并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的重要藥物[13]。研究發(fā)現(xiàn)，多種中藥成分(如葛根素、槲皮素、川芎嗪和山莨菪堿等)具有抑制AGEs形成的作用，其抑制機制主要有2種，分別為抑制非酶糖化反應(yīng)早期產(chǎn)物Amadori的形成以及與Amadori反應(yīng)阻止非酶糖化反應(yīng)終產(chǎn)物AGEs的形成[14]。本研究結(jié)果表明：枇杷葉三萜酸類成分對Amadori形成有顯著抑制作用，但對AGEs形成的抑制作用較弱。

綜上所述，枇杷葉中三萜酸類成分具有潛在的治療糖尿病及其并發(fā)癥的作用，但由于本實驗僅為體外實驗，關(guān)于其體內(nèi)活性還有待進一步研究。