何平，李開雙，饒偉源，鄒佳峻，曾憲彪

1右江民族醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，廣西百色533099;2廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院

蒽貝素是從野生紫金?？扑崽僮訉僦参锼崽僮覽1]果實(shí)提取分離的純結(jié)晶。據(jù)《廣西藥用植物名錄》等中醫(yī)傳統(tǒng)書籍記載，酸藤子能驅(qū)除腸道絳蟲，治療風(fēng)濕骨痛和婦女濕熱帶下等疾病。國外傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)也用酸藤子治療感冒發(fā)熱、胃腸功能紊亂、肝炎、肝硬化腹水以及慢性皮膚感染等疾病，也用于避孕節(jié)育[2]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，從酸藤子提取的蒽貝素是一種促細(xì)胞凋亡活性物質(zhì)，對許多XIAP高表達(dá)腫瘤(胰腺癌[3]、前列腺癌[4]、肝癌[5])細(xì)胞有促凋亡作用，此外很多研究也發(fā)現(xiàn)蒽貝素有肝損害保護(hù)[6]等作用。近年我們在研究蒽貝素對肝臟的保護(hù)作用過程中，發(fā)現(xiàn)蒽貝素對肝細(xì)胞有絲分裂是有影響的。推測蒽貝素極有可能是通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和破壞腫瘤細(xì)胞有絲分裂雙重途徑，發(fā)揮其抗腫瘤作用。腫瘤的生長持征是細(xì)胞分裂活躍和腫瘤組織無序增長，終止腫瘤細(xì)胞有絲分裂是抗腫瘤治療的有效途徑之一。2018年8月～2019年4月,蒽貝素抗腫瘤機(jī)理除了誘導(dǎo)XIAP高表達(dá)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡外，是否還通過終止腫瘤細(xì)胞有絲分裂機(jī)理發(fā)揮其抗腫瘤作用，國內(nèi)外相關(guān)研究少見報(bào)道。本研究觀察了蒽貝素對正常肝細(xì)胞有絲分裂的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、儀器、試劑 昆明小白鼠50只，體質(zhì)量(20±2)g，雌、雄各半，由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。生產(chǎn)許可證號SCXK桂2016-0004。飼養(yǎng)于溫度(23±2)℃，相對濕度70%±5%的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。蒽貝素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(美國西格瑪公司，批號022M4726V),25%氨水(廣東光華科技股份有限公司，批號20180725)，無水乙醇(廣東光華科技股份有限公司，批號20180423)，甲醛(廣東光華科技股份有限公司，批號20150310)，蘇木素-伊紅染色液(雷根生物公司，批號DH0006)。電子天平(上海精密儀器廠)，病理切片機(jī)(德國萊卡公司)，生物顯微鏡(德國萊卡公司)。

1.2 蒽貝素提取、弱堿性蒽貝素氨水溶液配制 按文獻(xiàn)[7]方法，從酸藤子果實(shí)提取分離的橙黃色結(jié)晶，不溶于水，可溶于堿性氨水溶液，易溶于乙醇，在避光密封條件下保存于5 ℃冰箱，2年內(nèi)鑒定和使用。經(jīng)理化常數(shù)、質(zhì)譜、紅外光譜、1HNMR，13CNMR測定的數(shù)據(jù)與Mahendra等[8，9]報(bào)道的蒽貝素?cái)?shù)據(jù)一致。弱堿性蒽貝素氨水溶液配制參照文獻(xiàn)[10]：精密稱取蒽貝素2.4 g(0.008 2克分子)，用30 mL無水乙醇預(yù)溶，加入等克分子量氨(以6.8 mL 0.25%氨水=0.001克分子氨計(jì)，0.008 2克分子氨約等于56 mL 0.25%氨水)混勻，水浴加熱(52 ℃)，減壓蒸發(fā)(-0.8帕)，揮除乙醇，再以0.025%氨水調(diào)整剩余藥液至1 200 mL，使之成質(zhì)量濃度為2 mg/mL(以蒽貝素量計(jì)，下同)母溶液備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)取母溶液用0.025%氨水稀釋成0.02、0.01.0.001 25 mg/mL弱堿性蒽貝素氨水溶液(pH值8.2)使用。

1.3 小白鼠分組及弱堿性蒽貝素氨水溶液灌胃 取昆明小白鼠50只，隨機(jī)分為蒽貝素高、中、低劑量組，溶劑組，空白組，每組10只。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，蒽貝素高、中、低劑量組分別灌胃濃度0.02、0.01、0.001 25 mg/mL的弱堿性蒽貝素氨水溶液20 mL/kg，劑量分別為0.4、0.2、0.025 mg/kg，溶劑組灌胃0.025%氨水溶液(pH 8.2)20 mL/kg，空白組灌胃蒸餾水20 mL/kg， 均1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后次日，取肝臟作組織病理學(xué)檢查。

1.4 肝組織病理學(xué)檢查、分裂相肝細(xì)胞核物質(zhì)觀察 取肝臟組織用10%甲醛溶液固定5 d，乙醇脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，片厚4.5 μm，蘇木素-伊紅染色。在100～400倍光鏡視野下觀察肝小葉及肝匯管區(qū)組織結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞變性、壞死、分裂狀態(tài)。在400～1 000倍光鏡視野下觀察分裂相肝細(xì)胞核染色體松散、碎裂狀態(tài)，觀察胞核兩極或兩子代細(xì)胞核染色體均等狀況。以核物質(zhì)著色特異、核染色體松散、碎裂、不均等分于胞核兩極或兩子代細(xì)胞為異常分裂肝細(xì)胞。以核物質(zhì)著色與正常肝細(xì)胞相同、細(xì)胞核兩極或緊密相鄰的兩子代細(xì)胞核物質(zhì)大致均等為正常分裂肝細(xì)胞。隨機(jī)取10個(gè)400倍視野，計(jì)數(shù)其中異常分裂肝細(xì)胞數(shù)和分裂相肝細(xì)胞總數(shù)(包含異常分裂肝細(xì)胞和正常分裂肝細(xì)胞)，計(jì)算10個(gè)視野中異常分裂肝細(xì)胞數(shù)占分裂相肝細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

弱堿性蒽貝素氨水溶液灌胃給藥后，小鼠表現(xiàn)為中樞興奮、活動增多，喜歡攀爬。灌胃給藥7 d后，各組小鼠狀態(tài)正常，無小鼠死亡。蒽貝素高、中、低劑量組,溶劑組，空白組小鼠肝組織大體病理表現(xiàn)基本一致，各組肝組織切片觀察見：肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，中央靜脈和肝竇無明顯擴(kuò)張。肝細(xì)胞無變性、壞死，從細(xì)胞和細(xì)胞核形態(tài)來看未見胞核染色體突變或細(xì)胞癌變的腫瘤細(xì)胞群。肝匯管區(qū)無明顯纖維結(jié)締組織增生，各級脈管及膽管未見明顯改變，未見有血液或膽汁瘀滯積聚征象。

正常分裂肝細(xì)胞核物質(zhì)著色與正常肝細(xì)胞一致，無特異性，多為兩個(gè)緊密相鄰且相似的子代肝細(xì)胞。異常分裂肝細(xì)胞核物質(zhì)著色特異，閃光透亮，核染色體呈松散麻花狀、碎片狀，條索狀或細(xì)粒狀。蒽貝素高、中劑量組分裂相肝細(xì)胞(正常分裂肝細(xì)胞、異常分裂肝細(xì)胞)數(shù)量較多，約占視野肝細(xì)胞總數(shù)5%～10%，呈點(diǎn)狀單個(gè)或雙個(gè)散在分布。可見分裂初期、中期、晚期異常分裂相肝細(xì)胞。在1 000倍光鏡下，分裂初期異常分裂肝細(xì)胞核物質(zhì)或核染色體呈閃光透亮的麻花狀，充滿胞核(圖1)。分裂中期異常分裂肝細(xì)胞(圖2)核染色體散裂成碎片狀、條索狀或細(xì)粒狀，不均等分布于肝細(xì)胞核非中心位置，或細(xì)胞核兩極。分裂晚期異常分裂肝細(xì)胞核物質(zhì)固縮成細(xì)粒狀，不均等分布于兩個(gè)子代肝細(xì)胞核(圖3)。這些分裂晚期子代肝細(xì)胞從核固縮形態(tài)和核染色體不均等看，都是已經(jīng)死亡的肝細(xì)胞。死亡子代肝細(xì)胞數(shù)量較多，且與給藥劑量正相關(guān)，給藥劑量越大數(shù)量越多，最高可達(dá)視野肝細(xì)胞總數(shù)的10%。低劑量組正常分裂肝細(xì)胞和異常分裂肝細(xì)胞都極少見，甚至沒有，在400倍光鏡下，正常分裂肝細(xì)胞和異常分裂肝細(xì)胞占視野肝細(xì)胞總數(shù)不到0.5%。空白組和溶劑組少見正常分裂肝細(xì)胞，未見異常分裂肝細(xì)胞，在1 000倍光鏡下，正常分裂肝細(xì)胞占視野肝細(xì)胞總數(shù)不到0.5%。

蒽貝素高、中、低劑量組，溶劑組，空白組分裂相細(xì)胞總數(shù)分別為(35.4±3.95)、 (14.7±3.68)、(4.8±3.16)、(2.4±1.84)、(2.2±1.87)個(gè)/10個(gè)視野，異常分裂細(xì)胞數(shù)分別為(28.3±5.96)、(7.6±2.88)、(0.6±1.01)、0、0個(gè)/10個(gè)視野，異常分裂細(xì)胞數(shù)占分裂相細(xì)胞總數(shù)百分?jǐn)?shù)分別為80.4%±16.1%、53.4%±19.8%、7.2%±11.8%，蒽貝素高、中劑量組各指標(biāo)高于空白組或溶劑組(P均<0.05)。

3 討論

機(jī)體細(xì)胞活動，如細(xì)胞有絲分裂中的核染色體移動、細(xì)胞清除異物的吞噬活動等，都需要能量(ATP)參與。核染色體移動依靠蛋白微絲拖動，蛋白微絲工作必須有ATP參與才能完成。這些ATP則源自細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝。碳水化合物的三羧酸循環(huán)和一些其他物質(zhì)的旁路代謝是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝和ATP產(chǎn)生的主要途徑，其中有電子傳遞過程，自然情況下電子傳遞是依靠輔酶Q來完成。輔酶Q的分子特征是帶長烷基側(cè)鏈的醌結(jié)構(gòu)。有研究[10,11]認(rèn)為，一些與輔酶Q有相似結(jié)構(gòu)的醌類物質(zhì)，如艾地苯醌等也有同樣的電子傳遞作用。蒽貝素的分子特征也是帶長烷基側(cè)鏈的對苯醌結(jié)構(gòu)，Makawiti等[12]的研究認(rèn)為帶長烷基側(cè)鏈的脂溶性苯醌，如艾地苯醌和蒽貝素等苯醌類物質(zhì)，能很好地穿過細(xì)胞膜脂質(zhì)，溶入線粒體，參與細(xì)胞內(nèi)糖代謝的電子傳遞過程，活躍線粒體內(nèi)的氧化磷酸化反應(yīng)和三羧酸循環(huán)反應(yīng)，加強(qiáng)線粒體內(nèi)ATP產(chǎn)出，增強(qiáng)細(xì)胞活力。 本實(shí)驗(yàn)中，蒽貝素高、中劑量組見大量異常分裂肝細(xì)胞，說明蒽貝素可以破壞肝細(xì)胞有絲分裂，使子代肝細(xì)胞死亡，其原因可能是蒽貝素參與了肝細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝和ATP產(chǎn)生過程，起電子傳遞作用，與輔酶Q協(xié)同或疊加強(qiáng)電子傳遞和ATP產(chǎn)出。較多的ATP可能加強(qiáng)了肝細(xì)胞生命活力和蛋白微絲收縮力，一方面，強(qiáng)大生命活力使細(xì)胞對肝細(xì)胞生長因子刺激響應(yīng)加強(qiáng)，肝細(xì)胞分裂活躍；但另一方面，大量ATP給蛋白微絲提供能量，又使細(xì)胞核中的蛋白微絲產(chǎn)生過多的出力，核染色體受蛋白微絲過度拉動，變成松散狀態(tài)，或在向細(xì)胞極體移動中受拉過度而碎裂和不均等分配。核染色體不均等分配的有絲分裂最終結(jié)果是子代肝細(xì)胞死亡,最終形成無肝實(shí)質(zhì)增長的無效肝細(xì)胞分裂。

圖1 分裂初期異常分裂肝細(xì)胞(HE染色，×1 000倍)

圖2 分裂中期異常分裂肝細(xì)胞(HE染色，×1 000倍)

圖3 分裂晚期異常分裂肝細(xì)胞 (HE染色，×1 000倍)

已有研究[13]表明，蒽貝素有第二線粒體源光氨酸酶激活劑樣分子黏性，能與X-連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)分子中的BIR3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，解除XIAP對光-天氨酸蛋白酶的抑制，引發(fā)下游聯(lián)級反應(yīng)，最終激活caspase-3和導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，有促進(jìn)XIAP高表達(dá)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，起抗腫瘤作用。本研究見蒽貝素破壞正常肝細(xì)胞有絲分裂，使異常分裂的子代肝細(xì)胞核死亡。腫瘤發(fā)生和發(fā)展的特征是細(xì)胞分裂非?；钴S和腫瘤組織無序增長，終止其細(xì)胞分裂是抗腫瘤的有效途徑。蒽貝素能破壞肝細(xì)胞有絲分裂，我們推測其同樣潛在終止腫瘤細(xì)胞分裂活性，所以蒽貝素抗腫瘤機(jī)理除了誘導(dǎo)XIAP高表達(dá)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡外，是否還通過終止腫瘤細(xì)胞有絲分裂途徑發(fā)揮其抗腫瘤作用，有待進(jìn)一步用腫瘤細(xì)胞或荷瘤動物模型試驗(yàn)驗(yàn)證。