曾志棚，周 潔，盧偉敏，陳俏媛，賀思諾，林萬華*

(1. 廣西高校干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西師范大學(xué))，廣西 桂林 541006；2. 廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006；3. 廣西師范大學(xué) 校醫(yī)院，廣西 桂林 541006)

短鏈脫氫/還原酶蛋白(short-chain dehydrogenase reductase, SDR)超家族是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的最大蛋白家族之一，可在所有生命體內(nèi)(包括古細(xì)菌、細(xì)菌和真核生物)發(fā)現(xiàn)。目前人們已在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了75個(gè)SDR蛋白[1]，已有若干個(gè)SDR基因被證實(shí)與阿爾茨海默癥、癌癥和肥胖等的發(fā)生有關(guān)[2-5]。SDR9C7基因是短鏈脫氫/還原酶(SDR)蛋白超家族成員之一，首先從胚胎成纖維細(xì)胞中分離克隆得到，在成年鼠和成人體內(nèi)只有肝臟組織特異性高表達(dá)[6]。Takeichi等[7]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SDR9C7基因純合缺失突變時(shí)，可能會造成角質(zhì)細(xì)胞中板層顆粒脂質(zhì)的異常代謝和合成缺陷，導(dǎo)致角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)缺乏，進(jìn)而引起板層魚鱗病。而Lindholm-Perry等[8]則發(fā)現(xiàn)在低料肉比的肉牛中，腸系膜脂肪組織中Sdr9c7等基因的表達(dá)增高，致使視黃酸的合成增多，而視黃酸的增加可能在減少這些動(dòng)物的體質(zhì)量和肥胖方面發(fā)揮作用。由于Sdr9c7基因?qū)w質(zhì)量和肝臟脂肪代謝的影響尚不清楚，Sdr9c7基因敲除后會導(dǎo)致純合子小鼠出生后死亡(另文報(bào)道)，無法得到純合型Sdr9c7基因敲除小鼠，因此本文使用雜合子小鼠與野生型小鼠分組對Sdr9c7+/-小鼠的生長發(fā)育、高脂飼喂條件下血液生理生化指標(biāo)及肝臟石蠟組織切片進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sdr9c7+/-小鼠由本課題組設(shè)計(jì)，委托賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司(Cyagen Biosciences Inc)運(yùn)用TALEN 技術(shù)靶向Sdr9c7基因進(jìn)行敲除而得。小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體(specific pathogen free)級動(dòng)物房，每日晝夜周期為12 h，室內(nèi)溫度保持(25±2) ℃，自由采食和飲水。

1.2 材料與試劑

鼠尾裂解液(100 mmol/L Tris-Cl、5 mmol/L EDTA、200 mmol/L NaCl、20 g/L SDS)，2×Taq PCR Master Mix(購自Tiangen公司)，波氏固定液、二甲苯、蘇木素和伊紅染色液(購自索萊寶公司)。普通飼料購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。高脂飼料購自上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司(Research Diets，貨號D12492(滅菌))，其熱量構(gòu)成比為碳水化合物20%、脂肪60%、蛋白質(zhì)20%，總熱量為5.24 kcal/g。葡萄糖(GLU)、血清總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、低密度膽固醇(LDL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、尿素(BUN)、肌酐 (CREA)等測定試劑購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。

1.3 小鼠基因型鑒定

小鼠出生1周后，對其進(jìn)行編號并采集鼠尾組織提取DNA，PCR擴(kuò)增DNA，1%凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小無誤后，將PCR產(chǎn)物交由天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司測序，根據(jù)測序結(jié)果確定小鼠的基因型。

1.4 普通飼料和高脂飼料飼喂條件下小鼠生長曲線繪制

以分別來自8窩的同周齡雜合子型(Sdr9c7+/-) 和野生型(Sdr9c7+/+)8對雄性小鼠作為實(shí)驗(yàn)用鼠，分為mSdr9c7+/+組和mSdr9c7+/-組，普通飼料飼喂，每周稱體質(zhì)量至16周齡，繪制生長曲線。同樣方法取8對雄性小鼠，5周齡時(shí)開始飼喂高脂飼料，每周稱體質(zhì)量至28周齡，繪制生長曲線。

1.5 高脂飼喂小鼠血清采集及各項(xiàng)生化指標(biāo)測定

高脂飼料喂養(yǎng)至15和28周齡時(shí)，鼠尾采血法收集0.2～0.3 mL血液至1.5 mL離心管中，室溫靜置30 min，血液凝固析出血清，2 000 r/min離心10 min后分離出血清，用全自動(dòng)生化分析儀(迪瑞 CS-600B)檢測小鼠的GLU、TCHO、TG、LDL、ALT、AST、BUN、CREA等生理生化指標(biāo)。

1.6 高脂飼喂小鼠肝臟系數(shù)測定和組織石蠟切片

高脂喂食28周齡時(shí)，眼球放血法處死小鼠，將完整肝臟取出，PBS液清洗后用紙巾吸去多余PBS并稱量，計(jì)算肝臟系數(shù)： 肝臟系數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.7 小鼠組織石蠟切片制備與觀察

將肝臟組織剪成厚度0.3～0.5 cm，長寬不超過1 cm的小塊，用波氏固定液固定24 h。取已固定好的肝臟組織流水沖洗12 h，通過系列梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(10 μm厚)、二甲苯和系列梯度酒精脫蠟復(fù)水，蘇木精-伊紅染色法染色，中性樹脂封片，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肝臟組織石蠟切片并拍照保存，用Image J軟件分析40倍組織切片圖像中肝細(xì)胞脂質(zhì)空泡面積占總面積的百分比。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定

野生型測序圖譜中小鼠含有完整 (AGCTGCAGACC) 片段，雜合子小鼠的測序圖譜中(AGCTGCAGACC) 片段缺失，且其后出現(xiàn)2個(gè)峰的疊加，如圖1所示。

圖1 小鼠基因型測序圖譜Fig. 1 Genotype sequencing map of mouse

2.2 小鼠生長曲線

普通飼料喂養(yǎng)或高脂飼料喂養(yǎng)條件下，與野生型小鼠(mSdr9c7+/+)相比，雜合子小鼠(mSdr9c7+/-)正常生長發(fā)育與繁殖，二者的體質(zhì)量生長曲線無顯著差異，詳見圖2和圖3。

圖2 普通飼料喂養(yǎng)條件下野生型小鼠(mSdr9c7+/+)與雜合子小鼠(mSdr9c7+/-)的生長曲線Fig. 2 Growth curve of wild type mice (mSdr9c7+/+) and heterozygous mice (mSdr9c7+/-) fed with regular chow

圖3 高脂飼料喂養(yǎng)條件下野生型小鼠(mSdr9c7+/+)與雜合子小鼠(mSdr9c7+/-)的生長曲線Fig. 3 Growth curve of wild type mice (mSdr9c7+/+) and heterozygous mice (mSdr9c7+/-) fed with high-fat diet

2.3 肝臟系數(shù)

高脂飼料喂養(yǎng)24周后，雜合子小鼠(mSdr9c7+/-)的肝臟系數(shù)(0.045 0±0.002 9)與野生型小鼠(mSdr9c7+/+)的肝臟系數(shù)(0.042 0±0.002 6)相比，二者并無顯著差異(P>0.05)，如圖4所示。

圖4 高脂飼料喂食24周后小鼠肝臟系數(shù)Fig. 4 Liver coefficient of mice after 24 weeks of high-fat diet

2.4 小鼠肝臟組織石蠟切片

高脂飼料喂食24周后，兩組小鼠的肝臟均發(fā)生明顯的脂肪變性，光學(xué)顯微鏡下觀察到肝細(xì)胞脂質(zhì)空泡明顯形成，但兩組間空泡面積并無顯著差異(mSdr9c7+/+占比為(54.20±1.062)%，mSdr9c7+/-占比為(55.68±0.931)%)，如圖5所示。

圖5 高脂飼料喂食24周后野生型小鼠(mSdr9c7+/+)與雜合子小鼠(mSdr9c7+/-)的肝臟組織石蠟切片F(xiàn)ig. 5 Paraffin sections of liver tissue of wild type mice(mSdr9c7+/+) andheterozygous mice (mSdr9c7+/-) after 24-week high-fat diet

2.5 血液生理生化指標(biāo)

當(dāng)小鼠高脂飼料喂食11周后，與mSdr9c7+/+組相比，mSdr9c7+/-組的各項(xiàng)血液生理生化指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)；而當(dāng)喂食24周后，與mSdr9c7+/+組相比，mSdr9c7+/-組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)的酶活性顯著增高(P<0.05)，但葡萄糖(GLU)、血清總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、低密度膽固醇(LDL)、尿素(BUN)、肌酐 (CREA)等指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)，如表1所示。

表1 高脂飼料喂食后小鼠的各項(xiàng)血液生理生化指標(biāo)

注：與mSdr9c7+/+相比，*表示P<0.05。

3 討論

本文實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Sdr9c7+/-雜合子小鼠的生長發(fā)育未受到明顯影響，與野生型小鼠相比生長曲線無顯著差異。高脂飼料喂食小鼠制備肥胖動(dòng)物模型是目前研究肥胖、高脂血癥及肝臟非酒精性脂肪性肝病的通用手段，血液生理生化指標(biāo)對脂肪肝的診斷和鑒別有重要的參考意義[9-10]。本文通過測定高脂飼料喂食后小鼠的各項(xiàng)血液生理生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)用于檢測血糖血脂的生理指標(biāo)(包括GLU、TCHO、TG、LDL等)在雜合子小鼠和野生型小鼠兩組間并無顯著性差異，兩組間肝臟系數(shù)亦無明顯差異，肝臟組織的石蠟切片結(jié)果也顯示兩組小鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)無明顯差異，由此推測Sdr9c7基因沒有參與調(diào)控肝臟的脂肪沉積。此外，本文還檢測了BUN和CREA的生理指標(biāo)，結(jié)果顯示兩組間并無顯著性差異。但在高脂喂食24周后，雜合子小鼠血清中AST和ALT的含量較野生型小鼠的含量顯著增加(P<0.05)。AST和ALT是檢測肝功能的主要指標(biāo)，當(dāng)發(fā)生肝損傷時(shí)，其含量上調(diào)，而在成年鼠和成人體內(nèi)SDR9C7基因的表達(dá)呈肝臟組織特異性高表達(dá)[6]，因此推測Sdr9c7可能與肝臟的炎癥發(fā)生有一定的聯(lián)系。相關(guān)報(bào)道表明SDR9C7基因的表達(dá)與皮炎相關(guān)[7，11-12]。Sdr9c7+/-雜合子小鼠在高脂飼料飼喂條件下發(fā)生更嚴(yán)重的肝炎的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。