秦青， 宋楊， 劉佳， 李強

1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院（西北醫(yī)院）口腔科，陜西西安（710003）； 2. 解放軍第986 醫(yī)院口腔科，陜西 西安（710054）； 3. 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，陜西 西安（710032）； 4. 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 陜西省口腔疾病國際聯(lián)合研究中心 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院急診與綜合臨床科，陜西西安（710032）

牙周骨量喪失是牙周炎患者牙齒松動、缺失的重要原因之一。因此，維持牙周現(xiàn)有骨量或逆轉(zhuǎn)牙周骨量喪失成為牙周炎治療的研究熱點。人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）作為人牙周組織中重要的干細(xì)胞來源，其成骨分化能力對牙周骨量的維持具有重要作用［1］。酪蛋白激酶2 相互作用蛋白1（casein kinase 2 interacting protein-1，CKIP-1）是新發(fā)現(xiàn)的一種重要的骨形成負(fù)調(diào)控因子。有研究顯示，下調(diào)CKIP-1 既可促進成骨細(xì)胞的成骨能力，又可促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化進程；應(yīng)用CKIP-1 特異性siRNA 可對多種骨質(zhì)疏松動物模型產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)骨量喪失的作用［2-3］。另有研究也顯示，CKIP-1 的下調(diào)可以減輕實驗性牙周炎大鼠的牙周骨量喪失程度［4］，但具體機制尚未闡明。本研究將通過siRNA 干擾技術(shù)下調(diào)hPDLSCs 內(nèi)的CKIP-1 水平，觀察CKIP-1 對hPDLSCs 的成骨分化能力及成骨相關(guān)因子的表達影響，并探索骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號通路的調(diào)控功能，以期為CKIP-1 特異性siRNA 應(yīng)用于牙周炎臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM 培養(yǎng)基、100 mL/L 新生牛血清（Gibco，美國）；10 g/L 青霉素/鏈霉素、引物、CKIP-1 siRNA慢病毒、CKIP-1 過表達慢病毒（GeneRay，上海吉凱）；成骨誘導(dǎo)液（第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院組織工程中心）；RNA 提取試劑盒（RNAiso Plus，Takara，日本）、實時熒光定量PCR 試劑盒（Takara，日本）；茜素紅染色及定量檢測試劑盒（上海生工）；分光光度計（BioTek，美國）；實時定量PCR 儀（Applied biosystems，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 hPDLSCs 原代培養(yǎng) 選取第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院門診因正畸需要拔除的牙體完整、無畸形、無牙體及牙周組織疾病的第二前磨牙40 個，分別來自20 例身體健康者，年齡15～22 歲。牙拔除后立即用0.01 moL/L PBS 沖洗，無菌條件下，用銳利刀片刮取根中1/3 區(qū)域的牙周膜組織，并將其切割成約1 × 1 mm3的小塊，并放置于6 孔板中（含150 mL/L FBS、0.292 mg/mL 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素及鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)基），在37 ℃、5% CO2及飽

和濕度條件下培養(yǎng)，每2 d 換液1 次，細(xì)胞從組織塊邊緣爬出后繼續(xù)培養(yǎng)7 d；待細(xì)胞生長融合至80%時，用胰酶/EDTA（0.25/0.1，pH＝6.4）消化傳代。本研究進行實驗的hPDLSCs 細(xì)胞均為P4 代。

1.2.2 hPDLSCs 鑒定 取培養(yǎng)的P4 代hPDLSCs，調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 106/mL，用40 g/L 多聚甲醛固定15 min；PBS 洗滌后分別加入鼠抗人CD105 單抗，室溫孵育1 h；再經(jīng)PBS 洗滌后分別加入羊抗鼠Ig-FITC，室溫避光貯存45 min；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD105 的表達水平。hPDLSCs 經(jīng)過成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 后，40 g/L 多聚甲醛固定細(xì)胞1 h，PBS 清洗3 次后，茜素紅染色20 min，再用PBS 洗去多余染色劑，光鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況，鑒定hPDLSCs 細(xì)胞的多向分化能力。

1.2.3 分組及慢病毒感染 取hPDLSCs 接種于培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5 × 104個/mL，并將其分為4 組：①空白對照組（Con）：細(xì)胞不感染任何慢病毒；②陰性對照組（shNC）：細(xì)胞感染空白質(zhì)粒慢病毒；③CKIP-1 siRNA 組（CKIP-1 siRNA）：細(xì)胞感染CKIP-1 siRNA 慢病毒；④CKIP-1 組（CKIP-1）：細(xì)胞感染CKIP-1 過表達慢病毒。感染方法：待細(xì)胞融合至80%時進行慢病毒感染，期間選用感染增強液提高感染效果。6 h 后換液，72 h 后進行收集細(xì)胞。將細(xì)胞按1 × 105個/孔的濃度接種于6 孔板中，無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.4 茜素紅染色及礦化結(jié)節(jié)的定量分析 取上述分組P4 代hPDLSCs，分別經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 后，進行茜素紅染色并于鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況；再取100 g/L 氯化十六烷基1 mL 室溫下吹打30 min 至鈣化結(jié)節(jié)完全溶解，吸取上清液300 μL，用紫外分光光度計562 nm 波長下測量A 值［5］。1.2.5 qPCR 檢測成骨調(diào)控因子和BMP 信號通路相關(guān)因子mRNA 水平 首先，分別取各組成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 的細(xì)胞，經(jīng)PBS 洗滌并離心后，調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 105個/mL，取1 mL，用Trizol 裂解各組hPDLSCs，分離RNA，并利用其作為模板進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，其中反轉(zhuǎn)錄所得cDNA 保存于-20 ℃冰箱中以防分解。按照Takara 公司的qPCR 試劑盒要求，加入上下游引物，利用qPCR 儀進行反應(yīng)，合成所設(shè)計的相關(guān)基因。對照基因選擇為β-actin，用2-ΔΔCt法統(tǒng)計分析各組間成骨相關(guān)因子Runt 相關(guān)轉(zhuǎn) 錄 因 子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator ofnuclear factor kappa-B ligand，RANKL）和I 型膠原（type I collagen，Coll I）的轉(zhuǎn)錄水平的差異，以及BMP 信號通路相關(guān)因子BMP2、泛素連接酶1（Smad ubiquitination regulatory factor 1，Smurf1）和Smad 家族成員4（mothers against decapentaplegic homolog 4，Smad4）水平差異。反應(yīng)條件：95 ℃，10 s；95 ℃，5 s；60 ℃30 s，40 個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 基因名稱和引物序列Table 1 The gene name and primer sequence

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計軟件繪制P-P 圖驗證數(shù)據(jù)正態(tài)性，單因素方差分析法驗證數(shù)據(jù)方差齊性。計量資料結(jié)果以x±s表示，兩組比較使用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q 法，并應(yīng)用Bonferroni 進行事后檢驗。以α＝0.05 為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 hPDLSCs 的鑒定

培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)呈長梭形類似成纖維樣細(xì)胞（圖1 a、b），茜素紅染色可見礦化結(jié)節(jié)（圖1c），且陽性表達間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD105（圖1d），符合hPDLSCs 表型特征。

2.2 慢病毒感染后hPDLSCs 的CKIP-1 mRNA 水平

Figure 1 Identification of hPDLSCs圖1 hPDLSCs 的鑒定

CKIP-1 si-RNA 水平方差齊性檢驗顯著性值為P＝0.234，滿足方差齊性，可采用單因素方差分析。qPCR 結(jié)果（圖2）顯示，空白對照組與陰性對照組內(nèi)CKIP-1 轉(zhuǎn)錄水平無明顯差異（P＝0.319），CKIP-1 siRNA 組CKIP-1 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平較陰性對照組顯著降低（P＝0.000），CKIP-1 過表達組CKIP-1 轉(zhuǎn)錄水平較陰性對照組顯著升高（P＝0.000）。

Figure 2 mRNA expression of CKIP-1圖2 CKIP-1 mRNA 表達水平

2.3 慢病毒感染后對hPDLSCs 成骨分化能力的影響

各組hPDLSCs 經(jīng)21 d 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，茜素紅染色結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，CKIP-1 siRNA 組具有更多的礦化結(jié)節(jié)，CKIP-1 過表達組成骨結(jié)節(jié)形成較少。用分光光度計法對礦化結(jié)節(jié)進行定量分析，礦化結(jié)節(jié)定量分析數(shù)據(jù)水平方差齊性檢驗顯著性值為P＝0.145，滿足方差齊性，可采用單因素方差分析。統(tǒng)計結(jié)果顯示，可見CKIP-1 siRNA 組細(xì)胞光吸收值更高（P＝0.036，vs.空白對照組；P＝0.038，vs.陰性對照組；P＝0.030，vs.CKIP-1 組），CKIP-1 過表達組吸光度值更低（P＝0.032，vs.空白對照組；P＝0.033，vs.陰性對照組；P＝0.030，vs.CKIP-1 組），說明CKIP-1 siRNA組細(xì)胞成骨分化效果更為顯著（圖3）。

2.4 成骨相關(guān)調(diào)控因子水平

Figure 3 Alizarin red staining and quantitative detection of the osteogenic differentiation ability of hPDLSCs圖3 茜素紅染色及定量檢測hPDLSCs 成骨分化能力

成骨相關(guān)調(diào)控因子水平數(shù)據(jù)方差齊性檢驗顯著性值均P＞0.05，滿足方差齊性，可采用單因素方差分析。qPCR 結(jié)果顯示（圖4），CKIP-1 siRNA組細(xì)胞成骨相關(guān)調(diào)控因子Runx2（P＝0.032）、ALP（P＝0.028）、OCN（P＝0.032）的轉(zhuǎn)錄水平均高于陰性對照組細(xì)胞，CKIP-1 過表達組成骨相關(guān)調(diào)控因子Runx2（P＝0.042）、ALP（P＝0.040）、OCN（P＝0.042）表達下降；同時，Coll I 作為成骨過程中的主要膠原纖維，CKIP-1 siRNA 組轉(zhuǎn)錄水平顯著升高（P＝0.026），而RANKL 作為破骨細(xì)胞分化的重要指標(biāo)，CKIP-1 siRNA 組轉(zhuǎn)錄水平未見明顯變化（P＞0.05）。提示CKIP-1 的作用主要針對hPDLSCs的成骨分化過程。

Figure 4 mRNA expresssion level of osteogenic regulatory factors圖4 成骨相關(guān)調(diào)控因子mRNA 表達水平

2.5 BMP 信號通路檢測

BMP 信號通路相關(guān)分子數(shù)據(jù)方差齊性檢驗顯著性值均P＞0.05，滿足方差齊性，可采用單因素方差分析。qPCR 結(jié)果（圖5）顯示，與對照組比較，CKIP-1 siRNA 組的BMP 信號通路相關(guān)因子BMP2（P＝0.010）、Smurf1（P＝0.017）和Smad4（P＝0.013）mRNA 水平有顯著提高，而CKIP-1 組BMP2（P＝0.032）、Smurf1（P＝0.026）和Smad4（P＝0.022）明顯下降，提示CKIP-1 可能通過影響B(tài)MP 信號通路活性，對hPDLSCs 成骨向分化進程產(chǎn)生影響。

3 討 論

hPDLSCs 作為人牙周組織重要的干細(xì)胞來源，對牙周組織抵抗炎癥、維持骨量、損傷修復(fù)等生理功能起到重要作用［6-7］。其中，hPDLSCs 的成骨分化能力對健康牙周組織的骨量維持、牙周炎狀態(tài)下的骨量保護、治愈狀態(tài)下骨量恢復(fù)均具有重要作用［8-9］。在一系列生理過程中，多種信號通路與細(xì)胞調(diào)節(jié)因子參與其中，可調(diào)控某些關(guān)鍵因子的含量或功能，進而促進hPDLSCs 的成骨分化能力。

Figure 5 mRNA expression level of BMP signal pathway related factors圖5 BMP 信號通路相關(guān)因子mRNA 表達水平

CKIP-1 具有高度的保守性，動物與人的CKIP-1 基因及蛋白極為相似，為CKIP-1 基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化提供了良好基礎(chǔ)。同時，CKIP-1 廣泛分布于機體中，在細(xì)胞生存、周期調(diào)控、細(xì)胞骨架形成和維持、蛋白細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運與亞細(xì)胞分布等多方面具有重要作用［10-12］。其中，CKIP-1 對于骨組織形成的負(fù)向調(diào)控作用也是研究關(guān)注的重點。研究顯示，CKIP-1 基因全身性敲除的小鼠相較于同窩、同性別的野生型小鼠具有更高的骨密度，且該作用隨年齡增長而越發(fā)顯著［13］。學(xué)者通過過量糖皮質(zhì)激素注射［3］和尾懸吊［14］等多種方法，分別制備了CKIP-1 基因敲除小鼠的激素性和失重性（或稱廢用性）骨質(zhì)疏松模型。結(jié)果顯示，CKIP-1 基因敲除可部分改善上述類型骨質(zhì)疏松小鼠的骨量丟失癥狀，影像學(xué)檢測可見CKIP-1 基因敲除小鼠長骨松質(zhì)骨區(qū)域骨量得到有效維持。還有研究顯示，miR-980可以通過干擾CKIP-1 提高成骨細(xì)胞成骨能力［18］。

另有研究顯示，CKIP-1 在成骨細(xì)胞中主要通過BMP 信號通路起作用。CKIP-1 可通過促進E3泛素連接酶Smurf1 的作用，提高其與底物的親和力，從而使BMP 關(guān)鍵的下游分子Smads 分解，進而抑制BMP 信號通路作用。而敲除或下調(diào)CKIP-1 表達水平可促進BMP 信號通路作用，從而發(fā)揮促進成骨細(xì)胞分化及成骨功能的發(fā)揮［15-16］。研究顯示，CKIP-1 基因敲除小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化進程顯著加快，從而對長骨骨量維持起調(diào)控作用［2］。目前，CKIP-1 對于骨組織影響的研究主要集中于肢體長骨松質(zhì)骨部分，而其對頜骨組織，尤其是牙周骨組織的影響報道較為有限［17］。研究顯示，下調(diào)CKIP-1 表達水平可在一定程度上緩解鼠牙周炎骨量喪失［4］，而CKIP-1 是否能影響hPDLSCs的成骨分化能力，進而在牙周骨量維持中起長期作用尚未報道。

本研究顯示，下調(diào)hPDLSCs 內(nèi)CKIP-1 轉(zhuǎn)錄水平可有效提高細(xì)胞中礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生，促進hPDLSCs成骨分化進程，下調(diào)CKIP-1 轉(zhuǎn)錄水平對hPDLSCs 成骨分化具有單方面的積極作用。此外，BMP 信號通路也是參與CKIP-1 調(diào)控hPDLSCs 成骨分化的重要分子機制。

總之，hPDLSCs 是牙周組織骨量維持的重要細(xì)胞基礎(chǔ)，下調(diào)CKIP-1 可以有效促進hPDLSCs 成骨分化能力。CKIP-1 對于牙周組織骨量的調(diào)控作用，為通過組織工程的方法治療牙周炎提供了新思路及實驗依據(jù)。