姚藝 ，黃俊杰 ，金馨 ，趙建新 ，夏崇建 ，童彥 ，高原 ，喻林升 ，范琰琰

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 溫州 325035）

皮膚是人體最大的器官，主要承擔(dān)著保護(hù)機(jī)體的重要生理功能。在法醫(yī)學(xué)研究中，皮膚損傷時間的準(zhǔn)確推斷能為案件性質(zhì)的界定和偵破提供線索。近年來，積極尋找與皮膚損傷愈合進(jìn)程相關(guān)的指標(biāo)成為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重要任務(wù)之一。

皮膚損傷愈合過程復(fù)雜，有多種細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子參與，涉及炎癥反應(yīng)、成纖維細(xì)胞增殖及新生毛細(xì)血管的生成。在炎癥階段，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放的炎癥細(xì)胞因子起關(guān)鍵作用[1]。既往研究[2]結(jié)果表明，細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）在皮膚損傷愈合過程中呈現(xiàn)動態(tài)變化，可作為推斷損傷時間的指標(biāo)。IL-33是一種IL-1細(xì)胞因子超家族成員，在人類皮膚組織細(xì)胞高表達(dá)[3]，是一種可被多種組織釋放的前炎癥因子[4]。同時，IL-33也是上皮組織修復(fù)的重要介質(zhì)，通過促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖或遷移從而促進(jìn)創(chuàng)口愈合[5]，但其在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中表達(dá)量的時間依賴性尚不明確。

在法醫(yī)學(xué)實踐中，除了皮膚擦傷和挫傷，缺損性皮膚損傷也較為常見，本研究采用皮膚打孔方式制作皮膚缺損性損傷模型，觀察IL-33在小鼠皮膚損傷模型中的表達(dá)規(guī)律和分布特性，探討IL-33在皮膚創(chuàng)口愈合過程中的作用及其在創(chuàng)口形成時間推斷中的參考價值。

1 材料與方法

1.1 樣本

成年普通ICR雄性小鼠50只，年齡8～10周，體質(zhì)量25～30 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。本實驗經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核通過，符合《實驗動物 福利倫理審查指南》要求。

1.2 小鼠皮膚損傷模型的建立與實驗分組

為了能夠更加直觀地觀察小鼠皮膚創(chuàng)口愈合情況以及準(zhǔn)確控制小鼠皮膚創(chuàng)口大小的一致性，本研究采用皮膚打孔方式制作皮膚缺損性損傷模型。將小鼠隨機(jī)分為對照組和創(chuàng)傷后1h、3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d組，每組5只。

創(chuàng)傷組小鼠于腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液（70mg/kg）麻醉后，將背部皮膚剃毛，75%乙醇溶液消毒處理，用圓形銼刀于背部中線兩側(cè)分別做一直徑為5mm的皮膚全層圓形切口[6]后分籠飼養(yǎng)，給予充足的食物和水，保持環(huán)境清潔干燥，防止創(chuàng)口感染。分別于創(chuàng)口形成后1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d將小鼠注射戊巴比妥鈉溶液過量麻醉處死，并以創(chuàng)口為中心取創(chuàng)口及周邊區(qū)1.0～2.0 cm范圍的皮膚。對照組小鼠過量麻醉處死后在與創(chuàng)傷組小鼠相同部位取同等大小的皮膚樣本。將取下的皮膚組織分為大小相同的4份，分別用于制作石蠟切片和Western印跡法檢測。

1.3 Western印跡法檢測

冰浴上在每組皮膚樣本中分別加入RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟（體積比為50∶1）的混合液300 μL，用剪刀將組織剪碎，組織勻漿，靜置30 min，4℃條件下以離心半徑10 cm，12 000 r/min，離心20 min，吸取上清液使用BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測蛋白濃度后將樣品置于-80℃保存。于樣品內(nèi)加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃金屬浴變性10min，上樣總蛋白量為50μg，在分離膠濃度為12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上進(jìn)行電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜（德國Merck公司）上，轉(zhuǎn)膜條件為200mA 45min。轉(zhuǎn)膜完成后用含有吐溫的Tris緩沖鹽溶液（Tris-buffered saline tween，TBST）洗滌3次，用5%脫脂牛奶室溫下封閉2h，用羊抗小鼠IL-33多克隆抗體（1∶1000，美國R & D Systems公司）孵育，4℃過夜。室溫下TBST洗滌3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊IgG二抗（1∶2000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）室溫孵育2h，TBST洗滌3次后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）法顯色。用ImageJ2x軟件分析各條帶的光密度值，以β微管蛋白（β-tubulin）作為內(nèi)參，計算各組IL-33蛋白表達(dá)的相對水平。

1.4 切片制備及染色觀察

將小鼠皮膚放入4%多聚甲醛溶液中固定12 h，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5 μm厚連續(xù)石蠟切片，置于37℃烘箱中烘干后置于4℃冰箱保存。

1.4.1 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色

切片置于65℃恒溫箱烤片30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木精染色7min，1%鹽酸-乙醇分化3 s后流水返藍(lán)30 min，1%伊紅染色1.5 min，蒸餾水5 min洗去多余染液，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察創(chuàng)口周圍組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟及水化，在3%甲醇配制的H2O2溶液中孵育10min以去除內(nèi)源性過氧化物酶，微波加熱修復(fù)法修復(fù)抗原。按照ZLI-9018免疫組織化學(xué)染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）說明書進(jìn)行操作，羊抗小鼠IL-33多克隆抗體（1∶200）作為一抗，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。在正置顯微鏡（日本Nikon公司）下觀察，每張切片在創(chuàng)口及其周邊區(qū)隨機(jī)選擇10個視野，計算陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值。

1.4.3 雙重免疫熒光染色

為了明確IL-33是否被巨噬細(xì)胞（Mφ）和肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MyFb）表達(dá)，對切片進(jìn)行雙重免疫熒光染色。切片常規(guī)脫蠟、水化、去酶、抗原修復(fù)后，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）配制的5%小牛血清溶液室溫封閉2 h。用封閉液稀釋作為一抗，滴加羊抗小鼠IL-33多克隆抗體（1∶200）和兔抗小鼠F4/80多克隆抗體（1∶100，英國Abcam公司），放在保濕盒中，置于4℃冰箱孵育12h，或滴加羊抗小鼠IL-33多克隆抗體（1∶200）和兔抗小鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）多克隆抗體（1∶100，英國Abcam公司），放在保濕盒中，置于4℃冰箱孵育12h。用PBS洗滌3次。Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗羊IgG（1∶200）和Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗兔IgG（1∶200，美國Jackson ImmunoResearch公司）避光條件下室溫孵育2 h，PBS洗滌3次。避光條件下用Hoechst 33258染色液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）復(fù)染細(xì)胞核，PBS洗滌3次，封片劑封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）下觀察，每張切片在創(chuàng)口及其周邊區(qū)隨機(jī)選擇10個視野進(jìn)行觀察、拍照、分析，統(tǒng)計IL-33陽性細(xì)胞中F4/80及α-SMA的陽性表達(dá)率。

1.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用進(jìn)行表示，使用SPSS 20.0軟件對Western印跡法條帶光密度值及細(xì)胞陽性率進(jìn)行t檢驗及單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Western印跡法檢測結(jié)果

以β-tubulin為內(nèi)參，對照組和創(chuàng)傷組均有IL-33陽性條帶（圖1）。

IL-33蛋白表達(dá)在傷后3 h與對照組相比稍有下降，6 h～3 d逐漸升高，3 d時達(dá)到峰值，之后逐漸下降。IL-33蛋白表達(dá)在傷后1d和3d均高于相鄰上組及對照組（P＜0.05），且傷后1～3 d IL-33蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度高于0.8（表1）。

圖1 小鼠皮膚創(chuàng)傷后不同時間點IL-33蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of IL-33 protein at different time points after skin wound in mice

表1 小鼠皮膚創(chuàng)傷后不同時間點IL-33蛋白的相對表達(dá)量Tab.1 Relative expression of IL-33 protein at different time points after skin wound in mice（n=5，±s）

表1 小鼠皮膚創(chuàng)傷后不同時間點IL-33蛋白的相對表達(dá)量Tab.1 Relative expression of IL-33 protein at different time points after skin wound in mice（n=5，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05。

組別對照傷后1h傷后3h傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后5d傷后7d傷后10d IL-33蛋白相對表達(dá)量0.80±0.25 0.52±0.24 0.59±0.011）0.72±0.59 0.77±0.54 0.88±0.031）2）0.97±0.031）2）0.76±0.062）0.69±0.132）0.58±0.091）

2.2 HE染色結(jié)果

與對照組相比，傷后1 h～3 d創(chuàng)口周圍炎癥細(xì)胞浸潤逐漸增加，之后漸漸減少。成纖維細(xì)胞于傷后3 d開始出現(xiàn)在創(chuàng)口周圍，傷后5 d數(shù)量增多，傷后7 d達(dá)到峰值。傷后5～7d創(chuàng)口周圍肉芽組織形成。傷后10 d，新生表皮覆蓋創(chuàng)口，肉芽組織開始向瘢痕組織轉(zhuǎn)變（圖2）。HE染色結(jié)果顯示，該皮膚損傷模型的創(chuàng)口愈合過程正常，符合炎癥的病理學(xué)發(fā)展規(guī)律。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

對照組皮膚的表皮、毛囊、皮脂腺及真皮中固有細(xì)胞有少量IL-33陽性表達(dá)。創(chuàng)傷組的皮膚創(chuàng)口及周邊區(qū)中，傷后6 h～3 d，IL-33的陽性染色主要出現(xiàn)在浸潤的炎癥細(xì)胞中，而在傷后5～7d，其陽性表達(dá)主要出現(xiàn)在成纖維細(xì)胞中。傷后10d，新生的表皮及成纖維細(xì)胞中仍有IL-33的陽性表達(dá)（圖3）。

經(jīng)細(xì)胞計數(shù)和統(tǒng)計，IL-33陽性細(xì)胞率于傷后3h開始增加（P＜0.05），傷后6h～1d陽性細(xì)胞率超過10%，傷后3～7d陽性細(xì)胞率超過20%，且在傷后3d達(dá)到峰值，陽性細(xì)胞率超過30%（表2）。

圖2 小鼠皮膚創(chuàng)傷后不同時間點損傷區(qū)的組織形態(tài)學(xué)變化（HE×400）Fig.2 Histomorphological changes of damage zone at different time points after skin wound in mice（HE×400）

圖3 小鼠皮膚創(chuàng)傷后不同時間點IL-33的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×200）Fig.3 Immunohistochemical staining results of IL-33 at different time points after skin wound in mice（×200）

表2 小鼠皮膚創(chuàng)傷后不同時間點IL-33的陽性細(xì)胞率Tab.2 The positive cell rate of IL-33 at different time points after skin wound in mice（n=5，±s，%）

表2 小鼠皮膚創(chuàng)傷后不同時間點IL-33的陽性細(xì)胞率Tab.2 The positive cell rate of IL-33 at different time points after skin wound in mice（n=5，±s，%）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05。

組別對照傷后1h傷后3h傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后5d傷后7d傷后10d IL-33陽性細(xì)胞率4.23±0.25 4.07±0.46 5.08±0.951）13.72±0.601）2）16.17±1.291）2）19.97±2.961）2）31.06±1.771）2）21.87±1.911）2）20.19±1.801）5.61±1.081）2）

2.4 雙重免疫熒光染色結(jié)果

創(chuàng)傷組的皮膚創(chuàng)口及周邊區(qū)中，部分IL-33陽性的炎癥細(xì)胞表達(dá)F4/80（Mφ的標(biāo)記物），于傷后6 h開始呈增多趨勢。傷后1 d，IL-33陽性的Mφ開始大量聚集在創(chuàng)口周圍。傷后3 d，IL-33陽性細(xì)胞中F4/80的陽性表達(dá)率達(dá)到峰值（＞60%，圖4，表3）。此后，隨著損傷時間的延長，IL-33陽性細(xì)胞中F4/80的陽性表達(dá)率逐漸降低。

傷后3d，創(chuàng)口區(qū)部分IL-33陽性細(xì)胞表達(dá)α-SMA（MyFb的標(biāo)記物）。傷后5d，IL-33陽性細(xì)胞中α-SMA的陽性表達(dá)率達(dá)到峰值（＞60%，圖5，表4）。隨著損傷時間的延長，IL-33陽性細(xì)胞中α-SMA的陽性表達(dá)率逐漸降低。

圖4 傷后3d皮膚創(chuàng)口區(qū)F4/80和IL-33的免疫熒光染色結(jié)果（×400）Fig.4 Immunofluorescence staining of F4/80 and IL-33 in skin incision 3d after injury（×400）

圖5 傷后5d皮膚創(chuàng)口區(qū)α-SMA和IL-33的免疫熒光染色結(jié)果（×400）Fig.5 Immunofluorescence staining of α-SMA and IL-33 in skin incision 5d after injury（×400）

表3 皮膚創(chuàng)傷后IL-33陽性細(xì)胞中F4/80的陽性表達(dá)率Tab.3 The expression rate of F4/80 in IL-33 positive cells after skin wound（n=5，±s，%）

表3 皮膚創(chuàng)傷后IL-33陽性細(xì)胞中F4/80的陽性表達(dá)率Tab.3 The expression rate of F4/80 in IL-33 positive cells after skin wound（n=5，±s，%）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05。

組別對照傷后1h傷后3h傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后5d傷后7d傷后10d F4/80陽性表達(dá)率8.7±3.5 8.3±2.7 9.8±1.6 15.7±3.21）2）27.5±4.31）2）47.2±5.81）2）62.7±1.41）2）43.0±2.41）2）41.2±6.51）30.2±4.31）2）

表4 皮膚創(chuàng)傷后IL-33陽性細(xì)胞中α-SMA的陽性表達(dá)率Tab.4 The expression rate of α-SMA in IL-33 positive cells after skin wound（n=5，±s，%）

表4 皮膚創(chuàng)傷后IL-33陽性細(xì)胞中α-SMA的陽性表達(dá)率Tab.4 The expression rate of α-SMA in IL-33 positive cells after skin wound（n=5，±s，%）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05。

組別對照傷后1h傷后3h傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后5d傷后7d傷后10d α-SMA陽性表達(dá)率5.4±0.9 4.8±1.9 5.2±2.2 5.4±1.5 6.6±1.9 8.2±3.4 41.4±3.91）2）64.8±5.71）2）49.5±4.51）2）24.1±2.41）2）

3 討 論

在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中，某些生物學(xué)指標(biāo)的規(guī)律性變化可以為損傷時間推斷提供良好的參考依據(jù)[7-8]。研究[9]結(jié)果顯示，參與皮膚創(chuàng)傷愈合的一些細(xì)胞因子，如IL-1α、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）等的表達(dá)隨著愈合過程的進(jìn)展呈動態(tài)變化，但這些指標(biāo)的動態(tài)變化無明確的時間分界且相互重疊，因此，皮膚損傷時間的推斷僅靠單一的生物學(xué)指標(biāo)是不夠的，需要綜合檢測多種細(xì)胞因子的表達(dá)以及運(yùn)用不同的檢測手段如形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等，可以增加皮膚損傷時間推斷的準(zhǔn)確性，減少單一指標(biāo)推斷的誤差。

IL-33是新型IL-1家族成員，主要在皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)為核蛋白[10]，在組織損傷或遭受物理刺激時釋放[11]，在適宜的刺激下，免疫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞均可產(chǎn)生IL-33[12]。研究[13-14]結(jié)果表明，IL-33不僅是一種前炎癥因子，也是一種雙功能細(xì)胞因子，其中全長IL-33（full-length IL-33，flIL-33）為核內(nèi)基因調(diào)節(jié)因子，成熟IL-33（mature IL-33，mIL-33）為細(xì)胞外細(xì)胞因子，從受損或壞死細(xì)胞中釋放后起作用。核IL-33可能通過抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抑制過度炎癥和維持細(xì)胞增殖或遷移進(jìn)而促進(jìn)上皮形成[15]，這表明IL-33可能通過抑制炎癥反應(yīng)促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖或遷移從而促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。研究表明，生長刺激表達(dá)基因2（growth stimulation expressed gene 2，ST2）蛋白是IL-33的特異性受體，是白細(xì)胞介素1受體/Toll樣受體（interleukin-1 receptor/Toll-like receptor，IL-1R/TLR）超家族的一員，IL-33可通過與其特異性結(jié)合誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子基因表達(dá)，促進(jìn)Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[3，16-17]，在感染、炎癥性疾病、結(jié)締組織重塑和纖維化中發(fā)揮重要作用[18-19]。當(dāng)炎癥開始后，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞相繼進(jìn)入炎癥區(qū)域，釋放促炎因子并激活抗炎癥反應(yīng)[20]，提示IL-33可能參與了皮膚創(chuàng)傷愈合炎癥反應(yīng)的調(diào)控。

為了確定IL-33是否能夠用于皮膚損傷時間的推斷，本研究通過建立小鼠皮膚損傷模型檢測了損傷后不同時間IL-33的表達(dá)變化。Western印跡法檢測結(jié)果顯示，IL-33蛋白表達(dá)在傷后3 h稍有下降，隨后在6h～3d逐漸升高，于傷后3d達(dá)到峰值，之后逐漸下降，IL-33蛋白在傷后1～3 d的表達(dá)強(qiáng)度高于對照組（P＜0.05），且在傷后 1～3 d蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度高于0.8。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，IL-33的陽性細(xì)胞率于傷后3 h開始增加，傷后6 h～1 d超過10%，傷后3～7 d超過20%，且在傷后3 d達(dá)到峰值，陽性細(xì)胞率超過30%。傷后6 h～3 d損傷區(qū)周圍可見較多炎癥細(xì)胞表達(dá)IL-33，傷后5～7d IL-33主要表達(dá)于成纖維細(xì)胞。為了明確在小鼠皮膚損傷愈合過程中是何種細(xì)胞表達(dá)IL-33，本研究應(yīng)用雙重免疫熒光染色對IL-33表達(dá)陽性的細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞種類鑒定。結(jié)果顯示，IL-33陽性表達(dá)的細(xì)胞主要是Mφ和MyFb。除了增加應(yīng)用雙重免疫熒光染色結(jié)果對IL-33表達(dá)陽性的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞種類鑒定，本研究還分別統(tǒng)計了損傷后不同時間F4/80（Mφ的標(biāo)記物）和α-SMA（MyFb的標(biāo)記物）在IL-33陽性細(xì)胞中的陽性表達(dá)率。IL-33和F4/80雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示，傷后1d，IL-33陽性的Mφ開始大量聚集在創(chuàng)口周圍，傷后3d，IL-33陽性細(xì)胞中F4/80的表達(dá)率達(dá)到峰值（＞60%），隨著損傷時間的延長表達(dá)率逐漸降低。IL-33和α-SMA雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示，IL-33陽性的MyFb于傷后3d開始出現(xiàn)在創(chuàng)口區(qū)，傷后5d，IL-33陽性細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)率達(dá)到峰值（＞60%），隨著損傷時間的延長表達(dá)率逐漸降低。HE染色結(jié)果顯示，皮膚創(chuàng)口愈合正常。從法醫(yī)病理學(xué)的角度分析，IL-33在創(chuàng)口愈合中的表達(dá)呈現(xiàn)一定的時間規(guī)律性，可用于損傷時間的推斷。

有研究結(jié)果顯示，IL-33/ST2信號通路參與炎癥和組織再生之間的平衡調(diào)節(jié)[21-22]，能夠促進(jìn)新的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積和血管生成[23]，在基質(zhì)合成和新血管形成中發(fā)揮重要作用。這說明IL-33作為一種炎癥細(xì)胞因子，通過IL-33/ST2信號通路調(diào)控皮膚損傷愈合的發(fā)展。本研究初步證實了IL-33參與皮膚損傷愈合的過程并隨著愈合過程的進(jìn)展呈時間依賴性變化，可用于動物創(chuàng)口形成時間的推斷。聯(lián)合形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)、細(xì)胞種類鑒定等實驗技術(shù)方法檢測IL-33在皮膚損傷愈合過程中的表達(dá)，綜合分析IL-33作為生物學(xué)指標(biāo)在皮膚損傷時間推斷中的應(yīng)用價值，可以使實驗分析結(jié)果更加客觀。研究[3]結(jié)果顯示，編碼人類IL-33的基因位于9號染色體（9p24.1），編碼了270個多肽組成的氨基酸，其中54%的氨基酸序列與小鼠具有同源性，提示IL-33可能為人類皮膚損傷時間推斷提供重要參考，但是IL-33表達(dá)并未在人體標(biāo)本中進(jìn)行驗證，而且其表達(dá)是否受皮膚損傷嚴(yán)重程度的影響也需要進(jìn)一步通過實驗進(jìn)行驗證。