胡毅愷，張恒，肖碧，陳龍

（1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032；2.上海市公安局物證鑒定中心 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083）

機(jī)械性窒息是指機(jī)械性暴力作用引起呼吸障礙所導(dǎo)致的窒息，其案發(fā)率僅次于機(jī)械性損傷，在我國(guó)暴力案件中排名第二[1]。目前機(jī)械性窒息的法醫(yī)學(xué)鑒定主要依靠縊痕、勒痕和一些非特異性的尸體征象（顏面水腫、器官淤血等），面對(duì)現(xiàn)場(chǎng)遭到破壞的復(fù)雜案例往往因缺乏特異性標(biāo)志物而難以完成精準(zhǔn)鑒定。線(xiàn)粒體對(duì)于缺氧環(huán)境極為敏感，其損傷標(biāo)志物或可作為診斷機(jī)械性窒息的依據(jù)，本文將闡述線(xiàn)粒體（mitochondrion）在缺氧環(huán)境中發(fā)生的特異性變化，并探討其運(yùn)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐的可能性。

1 線(xiàn)粒體

線(xiàn)粒體是真核細(xì)胞中一種獨(dú)特的細(xì)胞器，具有多形性、易變性、運(yùn)動(dòng)性和適應(yīng)性等特點(diǎn)。線(xiàn)粒體的主要功能是通過(guò)氧化磷酸化合成腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），為細(xì)胞活動(dòng)提供能量。正常成年人經(jīng)氧化磷酸化產(chǎn)生的能量占其機(jī)體產(chǎn)生總能量的80%以上[2]。據(jù)報(bào)道，機(jī)體所攝入的氧氣約90%在線(xiàn)粒體中被利用，其中2%經(jīng)線(xiàn)粒體內(nèi)膜電子傳遞系統(tǒng)（electron transfer system，ETS）產(chǎn)生氧自由基[3]，過(guò)量的氧自由基對(duì)細(xì)胞具有毒性作用[4]。缺氧時(shí)，ETS及氧化磷酸化途徑發(fā)生障礙，ETS中酶活性受到抑制，ATP合成受阻，產(chǎn)生過(guò)量氧自由基，使得線(xiàn)粒體受到損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞受損[5-6]。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始研究機(jī)體缺氧情況下線(xiàn)粒體的損傷及其機(jī)制。

2 缺氧狀態(tài)與機(jī)械性窒息

缺氧是指組織氧供減少或不能充分利用氧導(dǎo)致組織代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化的過(guò)程，人體組織中正常氧分壓水平約為3.2～8.8kPa（24～66mmHg），各組織對(duì)于缺氧的耐受性存在較大差異，神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等對(duì)缺氧較為敏感，而骨骼肌細(xì)胞、胃腸道平滑肌細(xì)胞及精細(xì)胞等對(duì)缺氧的耐受性較好。當(dāng)組織含氧量低于正常水平時(shí)，機(jī)體即進(jìn)入缺氧狀態(tài)。根據(jù)不同的病理生理機(jī)制，缺氧可細(xì)分為低張性缺氧、血液性缺氧、循環(huán)性缺氧及組織性缺氧等[7]。

機(jī)械性窒息是指機(jī)械性暴力引起呼吸障礙所導(dǎo)致的窒息，根據(jù)暴力的作用方式，可分為縊死、勒死、扼死、壓迫胸腹部所致窒息、捂死、悶死及梗死等多種形式。目前已有學(xué)者嘗試通過(guò)檢測(cè)死后血液pH值變化、血?dú)夥治鯷8]、血液離子濃度改變[9]、缺氧相關(guān)蛋白表達(dá)水平[10]、mRNA及miRNA標(biāo)志物水平[11-12]等諸多方法以推斷機(jī)械性窒息死亡。

機(jī)械性窒息的本質(zhì)是缺氧引起的中樞神經(jīng)功能障礙、呼吸和循環(huán)功能衰竭[13]，且持續(xù)時(shí)間往往較短，一般在數(shù)分鐘內(nèi)即可致人死亡。而在急性缺氧情況下，大量氧自由基誘發(fā)的脂質(zhì)氧化反應(yīng)、Ca2+超載、氧化磷酸化受抑制等一系列變化，都可以造成線(xiàn)粒體的損傷，在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為線(xiàn)粒體腫脹、脊斷裂溶解、外膜破裂和基質(zhì)外溢等[14]。

3 線(xiàn)粒體損傷在缺氧中的研究進(jìn)展

3.1 缺氧引起線(xiàn)粒體膜電位的降低

在缺氧環(huán)境下，機(jī)體線(xiàn)粒體膜電位的降低是受損的表現(xiàn)之一[15]，目前認(rèn)為其機(jī)制主要與線(xiàn)粒體解偶聯(lián)蛋白（uncoupling protein，UCP）活性的上調(diào)和線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的開(kāi)放相關(guān)。

由氧化磷酸化解偶聯(lián)引起的能量合成下降以及耗氧效率降低，被認(rèn)為是線(xiàn)粒體受損的最主要特征[16]。UCP是線(xiàn)粒體載體蛋白家族的一個(gè)亞族，定位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜，可將線(xiàn)粒體內(nèi)膜外的H+轉(zhuǎn)運(yùn)至基質(zhì)，降低線(xiàn)粒體的跨膜質(zhì)子電動(dòng)勢(shì)[17]。MURRAY等[18]發(fā)現(xiàn)在慢性心衰模型的大鼠心肌細(xì)胞中UCP3的表達(dá)量增加了53%，而其磷氧比值（adenosine diphosphateoxygen ratio，ADP/O）相比于對(duì)照組則明顯降低。研究[19]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以通過(guò)抑制腦缺血大鼠UCP2的表達(dá)達(dá)到提高線(xiàn)粒體ADP/O的作用，進(jìn)而減輕缺氧缺血性損傷對(duì)腦組織的損害。以上研究表明，UCP的活性增強(qiáng)并引起線(xiàn)粒體膜電位的降低是缺氧環(huán)境下線(xiàn)粒體損傷的重要表現(xiàn)之一。

mPTP開(kāi)放的增強(qiáng)是導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜電位降低的另一個(gè)主要因素[20]。在缺氧環(huán)境下，細(xì)胞膜表面的Na+-K+-ATP酶難以正常工作，線(xiàn)粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+外流以及谷氨酸受體啟動(dòng)增加等因素都可以導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)Ca2+數(shù)量上升，造成細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)鈣超載，可能導(dǎo)致細(xì)胞mPTP開(kāi)放[21]，mPTP的開(kāi)放可引起線(xiàn)粒體膜電位的下降，最終致ATP的耗竭[22]。

3.2 缺氧造成線(xiàn)粒體自噬

自噬是機(jī)體對(duì)物質(zhì)進(jìn)行循環(huán)利用并修正自身錯(cuò)誤的機(jī)制之一，線(xiàn)粒體自噬是指機(jī)體自身在精密調(diào)控下通過(guò)溶酶體清除線(xiàn)粒體的過(guò)程[23]。低氧環(huán)境可以誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生線(xiàn)粒體自噬，這一過(guò)程主要與Bcl-2/E1B-19000相互作用蛋白3（Bcl-2/E1B 19000-interacting protein 3，Bnip3）和 Bcl-2/E1B-19 000相互作用3樣（Bnip3-like，Bnip3L）蛋白通路的激活相關(guān)，Bnip3及其同系物Bnip3L的N端含有一個(gè)WXXL樣的基序，在其與自噬相關(guān)蛋白8（autophagy-related protein 8，ATG8）的結(jié)合中作用，而B(niǎo)nip3蛋白與ATG8的結(jié)合有助于線(xiàn)粒體與自噬體的對(duì)接，促進(jìn)自噬的發(fā)生[24]。此外，該通路激活可競(jìng)爭(zhēng)性地將Beclin-1從Bcl-2-Beclin-1或Bcl-XL-Beclin-1復(fù)合物中游離出來(lái)，游離狀態(tài)的Beclin-1可以參與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PIK3）復(fù)合體，該復(fù)合體可以調(diào)節(jié)多種Atg蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中的定位，從而激活自噬的發(fā)生[25]。目前發(fā)現(xiàn)，Bnip3及Bnip3L途徑的激活主要受到缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）和線(xiàn)粒體內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的影響[26]。

研究顯示，在機(jī)體缺氧條件下，HIF對(duì)于細(xì)胞代謝，血管再生，血細(xì)胞生成，細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過(guò)程起著重要的調(diào)節(jié)作用[27]。HIF-1由對(duì)氧分壓敏感的α亞基和對(duì)氧分壓不敏感的β亞基構(gòu)成[28]，在缺氧條件下，HIF-1α降解途徑受阻，進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-1β合成HIF-1[29]。HIF-1可以激活Bnip3通路以及Bnip3L通路，從而促進(jìn)線(xiàn)粒體自噬的發(fā)生。此外，在缺氧環(huán)境下，線(xiàn)粒體內(nèi)大量ROS生成。ROS能夠激活HIF-2α，并增加Bnip3的表達(dá)，以此促進(jìn)線(xiàn)粒體自噬的發(fā)生[30]。另外，ROS對(duì)于核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）也有激活作用，Nrf2因子可以誘導(dǎo)p62蛋白的表達(dá)，p62可以與輕鏈3（light chain 3，LC3）相互作用以促進(jìn)線(xiàn)粒體自噬的發(fā)生[31]，也有研究[32-34]指出，蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）因子的激活、PTEN誘導(dǎo)激酶（PTEN-induced putative kinase，PINK）的激活及線(xiàn)粒體內(nèi)腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）的堆積等因素均對(duì)低氧環(huán)境下線(xiàn)粒體的自噬有促進(jìn)作用。

3.3 缺氧導(dǎo)致線(xiàn)粒體分裂

在細(xì)胞面臨代謝或環(huán)境應(yīng)激時(shí)，線(xiàn)粒體融合與分裂的平衡對(duì)細(xì)胞功能的維系有重要意義，其中，線(xiàn)粒體的分裂可以產(chǎn)生新的線(xiàn)粒體。在應(yīng)激條件下促進(jìn)移除受損的線(xiàn)粒體以維持線(xiàn)粒體的質(zhì)量[35]。目前已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，線(xiàn)粒體的分裂主要由胞質(zhì)動(dòng)力蛋白家族成員線(xiàn)粒體發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）和線(xiàn)粒體分裂 1（mitochondrial fission 1，F(xiàn)is1）蛋白共同介導(dǎo)。

缺氧作為一種強(qiáng)烈的應(yīng)激源可以誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體的分裂[36]。有學(xué)者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺氧能夠誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞線(xiàn)粒體的分裂[37]。有報(bào)道[38]指出，當(dāng)缺氧導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載時(shí)，胞質(zhì)中的Ca2+可激活鈣調(diào)磷酸酶，使DRP1（S637）去磷酸化，導(dǎo)致其從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中聚集到線(xiàn)粒體外膜，促進(jìn)線(xiàn)粒體分裂。此外，也有學(xué)者[39]指出，大量ROS可以促使DRP1（S616）磷酸化水平升高，進(jìn)而活化DRP1，促進(jìn)線(xiàn)粒體的分裂。

目前，學(xué)界普遍認(rèn)為適度的線(xiàn)粒體分裂有助于清除受損的線(xiàn)粒體，但過(guò)度的線(xiàn)粒體分裂可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[40]，其具體意義及機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

3.4 缺氧誘導(dǎo)經(jīng)線(xiàn)粒體途徑的細(xì)胞凋亡發(fā)生

缺氧窒息可以誘導(dǎo)線(xiàn)粒體途徑的細(xì)胞凋亡，在生理?xiàng)l件下，促凋亡因子［Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、Bcl-2同源拮抗劑（Bcl-2 homologous antagonist/killers，Bak）等］與抗凋亡因子［B細(xì)胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）、B細(xì)胞淋巴瘤-XL（B cell lymphoma-XL，Bcl-XL）等］結(jié)合，不具有凋亡活性。當(dāng)細(xì)胞受到外界強(qiáng)烈刺激時(shí)，激活BH3-only蛋白（Bcl-2 homology-3 domain only protein），競(jìng)爭(zhēng)性抑制促凋亡因子與抗凋亡因子的結(jié)合，游離的促凋亡因子可以在線(xiàn)粒體外膜上形成蛋白通道，促使細(xì)胞色素C（cytochrome C）及第二線(xiàn)粒體源性半胱天冬酶激活劑（second mitochondria-derived activator of caspases，SMAC）釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。而后細(xì)胞色素C介導(dǎo)caspase-9的激活，SMAC則封閉X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）對(duì)caspase的抑制作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[41]。還有學(xué)者[42]發(fā)現(xiàn)，位于線(xiàn)粒體的Bax/Bak除可以介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放外，還可以調(diào)控線(xiàn)粒體內(nèi)凋亡相關(guān)因子的核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

已有研究[43]發(fā)現(xiàn)，在新生兒發(fā)生缺氧缺血后，Bax從Bcl-2及Bcl-XL上釋放，并向線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者[44]對(duì)肺泡上皮細(xì)胞在缺氧后受到的損傷進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)肺上皮細(xì)胞在缺氧環(huán)境下也會(huì)誘發(fā)凋亡的發(fā)生。另有學(xué)者利用轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)XIAP表達(dá)量上升時(shí)，缺氧缺血對(duì)其大腦的損傷作用有所減輕[45]，這也從側(cè)面印證了缺氧環(huán)境確實(shí)可以通過(guò)線(xiàn)粒體途徑誘發(fā)細(xì)胞的凋亡。

4 線(xiàn)粒體損傷在機(jī)械性窒息死因鑒定中的法醫(yī)學(xué)意義

法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中對(duì)窒息死亡的案例通常根據(jù)死者顏面部發(fā)紺、內(nèi)部器官淤血、“玫瑰齒”、上腔靜脈回流綜合征、Tardieu氏斑、尸斑彌漫暗紫紅色以及頸部索痕、扼痕、呼吸道堵塞等尸體征象，在排除其他死因后，結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)及案情分析方能給出“符合性”診斷。在面對(duì)案情不明、現(xiàn)場(chǎng)破壞或尸體征象不明顯（如使用柔軟物體覆蓋口鼻）的情況下，對(duì)于機(jī)械性窒息的診斷就極為困難[46]。

線(xiàn)粒體是機(jī)體內(nèi)消耗氧氣并產(chǎn)生能量的重要細(xì)胞器，其對(duì)于缺氧的發(fā)生極為敏感，當(dāng)機(jī)體面臨缺氧環(huán)境時(shí)，線(xiàn)粒體可以出現(xiàn)包括形態(tài)改變、膜電位下降、自噬、線(xiàn)粒體蛋白滲入胞質(zhì)及分裂等多種變化。在其他死因中，機(jī)體細(xì)胞在機(jī)體死亡后尚可利用機(jī)體血液中殘存的氧氣進(jìn)行一定程度上的呼吸，緩慢走向細(xì)胞死亡，細(xì)胞所經(jīng)歷的過(guò)程是一個(gè)慢性缺氧的過(guò)程。而在機(jī)械性窒息發(fā)生時(shí)，機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生劇烈的缺氧，細(xì)胞經(jīng)歷的是短時(shí)間內(nèi)急性缺氧的過(guò)程，對(duì)缺氧敏感的細(xì)胞（心、腦組織等）其線(xiàn)粒體有可能出現(xiàn)特征性的變化，這種變化如果能夠被法醫(yī)病理學(xué)工作者發(fā)現(xiàn)，將成為機(jī)械性窒息診斷的重要依據(jù)，且由于線(xiàn)粒體對(duì)于缺氧的敏感性，這些指標(biāo)可以在案情不明或現(xiàn)場(chǎng)遭到破壞等情況下給案件的偵查提供有價(jià)值的方向性線(xiàn)索。

目前，法醫(yī)學(xué)實(shí)踐對(duì)線(xiàn)粒體的運(yùn)用主要是將線(xiàn)粒體的DNA測(cè)序應(yīng)用于法醫(yī)物證學(xué)實(shí)踐[47]，而線(xiàn)粒體缺氧指標(biāo)有望作為組織經(jīng)歷缺氧窒息的證據(jù)，成為鑒定機(jī)械性窒息的輔助指標(biāo)之一?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)對(duì)于線(xiàn)粒體缺氧條件下的研究多著眼于細(xì)胞在慢性缺氧或缺血-再灌注情況下其線(xiàn)粒體發(fā)生的變化[48-50]，也有許多研究著眼于腫瘤細(xì)胞中線(xiàn)粒體的特征性病理生理學(xué)改變[51-52]，涉及細(xì)胞急性缺氧死亡或集體窒息死亡后線(xiàn)粒體變化的研究較少。

5 展 望

線(xiàn)粒體是人體內(nèi)與氧氣消耗直接相關(guān)的細(xì)胞器，對(duì)缺氧極為敏感。但是目前對(duì)于線(xiàn)粒體的研究尚不完善，尤其是對(duì)于其運(yùn)用于法醫(yī)病理學(xué)實(shí)踐的可能性的研究較少。

運(yùn)用線(xiàn)粒體相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行死因推斷的難點(diǎn)主要在于：（1）線(xiàn)粒體易降解，對(duì)于保存的要求較高；（2）線(xiàn)粒體的提取較為復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及實(shí)驗(yàn)室有一定的要求；（3）目前尚無(wú)成熟的可以運(yùn)用于法醫(yī)病理學(xué)實(shí)踐的線(xiàn)粒體損傷標(biāo)志物。針對(duì)以上問(wèn)題，我們認(rèn)為可以采取以下措施予以解決：（1）通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探索線(xiàn)粒體的降解規(guī)律，劃定可以運(yùn)用線(xiàn)粒體損傷標(biāo)志物的死亡時(shí)間范圍；（2）探究更為完善的線(xiàn)粒體提取及檢測(cè)技術(shù)，使線(xiàn)粒體損傷標(biāo)志物可應(yīng)用的死亡時(shí)間范圍更為廣泛；（3）進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，利用蛋白質(zhì)譜技術(shù)，尋找在不同死亡原因中表達(dá)有所差異的蛋白質(zhì)，圍繞所發(fā)現(xiàn)的蛋白探索其相關(guān)通路上可以用作死因推斷的指標(biāo)，并在此基礎(chǔ)上利用免疫印跡法、免疫熒光技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)等相關(guān)技術(shù)對(duì)所發(fā)現(xiàn)的指標(biāo)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣本及實(shí)際檢案人體樣本上進(jìn)行驗(yàn)證，以期發(fā)現(xiàn)可以用作機(jī)械性窒息死因推斷的線(xiàn)粒體相關(guān)指標(biāo)。

隨著對(duì)于線(xiàn)粒體損傷的研究逐漸加深，其標(biāo)志物或有助于在某些情況下判定死因是否為機(jī)械性窒息，將成為法醫(yī)病理學(xué)診斷中的一個(gè)重要補(bǔ)充。