李國雷 王赟 譚國梁 劉遠 徐曌 馮浩 興偉 徐志峰

癌癥的晚期經(jīng)常發(fā)生轉(zhuǎn)移，腫瘤的轉(zhuǎn)移導致約90%的癌癥死亡，使其成為了癌癥治療的焦點[1]。腫瘤細胞可以從原發(fā)部位遷移到循環(huán)系統(tǒng)（例如：血液、淋巴液和腦脊液等）然后擴散到其他器官。此時癌細胞亞群離開原發(fā)腫瘤，通過血液等循環(huán)遷移并定植到新的臟器組織形成新的腫瘤塊[2,3]。因此，早期識別通過血液循環(huán)傳播的癌細胞，即循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell,CTC），及時準確地檢測稀有和極少數(shù)CTC，對于癌癥治療的成功和改善患者的生存至關(guān)重要。CTC的存在與預后不良密切相關(guān)[4-6]，然而，血液中的CTC的豐度極低，在轉(zhuǎn)移的早期階段檢測CTC是一項挑戰(zhàn)，從患者獲得的7.5 mL血液樣本中識別和捕獲極少數(shù)的腫瘤細胞存在一定的困難[2,7]。

以往常用于檢測癌癥患者血液中CTC的技術(shù)較成熟的為CellSearch[8]，其他各種捕獲技術(shù)，包括免疫磁珠、功能化微納米結(jié)構(gòu)、活體流式細胞儀等也都正在發(fā)展與應用中[9-13]。其中，基于免疫化學的磁性納米顆?？梢愿咝屎透哌x擇性地識別和捕獲全血中的CTC。CellSearch是基于抗體包被的磁性納米顆粒連接上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）捕獲CTC的技術(shù)?？紤]到基于抗體的CTC捕獲技術(shù)的局限性，例如不能夠捕獲缺乏EpCAM蛋白的CTC或已經(jīng)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的CTC[14]，因此，捕獲此類CTC需要其他蛋白抗體修飾的磁珠才能夠?qū)崿F(xiàn)。

葉酸（folic acid, FA）已經(jīng)成為非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）患者的一個重要的潛在藥物靶點[15,16]。有研究[17]發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者中，F(xiàn)R表達上調(diào)約75.7%。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）蛋白在NSCLC中的陽性表達率為53%，在性別及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間陽性表達率有顯著差異，而在年齡、病理類型、腫瘤分化程度、吸煙史及臨床分期之間無顯著差異[18]。腫瘤細胞中的波形蛋白（Vimentin）可呈現(xiàn)過量表達，在NSCLC中，高表達的Vimentin蛋白可作為較差預后的獨立觀測指標；低表達的Vimentin則是患者良好生存質(zhì)量的獨立預測因子[19]。在這里，我們分別制備了EGFR、Vimentin、FA三種免疫脂質(zhì)體的磁性納米顆粒系統(tǒng)，用于NSCLC細胞的特異性靶向快速分離檢測，比較了分別使用EGFR、Vimentin、FA三種磁球?qū)SCLC CTC的捕獲效率及同時使用三種磁球的捕獲效率，并在真實世界中利用它們對臨床NSCLC患者血樣進行CTC捕獲，初步研究了其在臨床上的應用價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集本院2017年9月-2019年9月NSCLC患者血標本60例，樣本采集方法是用醫(yī)用抗凝采血管采集患者外周血7.5 mL，抗凝劑為EDTA·K2?；颊吣挲g36歲-75歲，中位年齡53.5歲，平均年齡55歲。同時招募20名健康志愿者，收集其全血作為實驗的對照。所有選取的病例均履行告知義務并簽署知情同意書。

1.2 細胞株 A549細胞株、HCC827細胞株、NCI-H1650細胞株、NCI-H3122細胞株均購自ATCC細胞庫。細胞中用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37oC，5%CO2，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 材料與儀器 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購于Gibco公司。CD45-PE購自eBioscience公司。CK-FITC和脂質(zhì)磁球購自舉康（上海）生物科技有限公司。DAPI染色液購自碧云天生物技術(shù)有限公司。EGFR抗體、Vimentin、FA購自獵源（上海）生物醫(yī)藥科技有限公司。普魯士藍染色試劑盒購自Solarbio公司。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSAPC-APCG）購自上海晟納實業(yè)有限公司。膽固醇（Chol）、二氯甲烷、及其他常用試劑均購自國藥公司。BI-90Plus激光粒度儀/Zeta電位儀購自美國布魯克-海文公司。XL-30型環(huán)境掃描電子顯微鏡購自荷蘭PHILIPS公司。LDJ9600-1型VSM磁性能測試儀購自美國數(shù)字儀器公司。OLYMPUS B×61型熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。超聲波細胞粉碎機型號JY92-IIDN，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀型號XD-52AA均購自上海般諾生物科技有限公司。

1.4 免疫脂質(zhì)磁球的制備 采用薄膜法制備EGFR免疫脂質(zhì)磁球，具體制備過程及試劑用量參閱參考文獻[20,21]。將PEG-DSPE、膽固醇、DOPC、GHDC、HQCMC、Fe3O4溶液共溶于二氯甲烷中，同時加入濃度為0.1 mol/L的PBS，pH為7.4，使用探針式超聲波儀對混合溶液進行超聲振蕩，功率為27%，超聲2 s，間隔1 s，總時間6 min，溫度25oC，使其完全乳化，得到脂質(zhì)磁球（LMB）溶液。取0.6 mg EGFR多肽溶于10 mL異丙醇中，分別加入偶聯(lián)劑1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide（EDC）和N-hydroxysuccinimide（NHS），保持4oC勻速攪拌24 h，即可獲得EGFR修飾的脂質(zhì)磁球。Vimentin和FA脂質(zhì)磁球的制備同EGFR脂質(zhì)磁球的制備。

1.5 免疫脂質(zhì)磁球的表征 免疫脂質(zhì)磁球的粒徑電位的測定采用BI-90Plus激光粒度儀/Zeta電位儀檢測，取10 μL樣品在1 mL蒸餾水中稀釋后，用于粒徑電位測試。免疫LMB的形態(tài)通過原子力顯微鏡（atomic force microscope,AFM）觀察，取10 μL樣品在1 mL蒸餾水中稀釋后，取50 μL涂于載玻片上，待干后進行測量。免疫LMB紫外吸收光譜檢測通過紫外分光光度計檢測，取10 μL樣品在1 mL蒸餾水中稀釋后，直接進行測量。磁球捕獲A549細胞的普魯士藍染色通過普魯士藍染色試劑盒，按其說明書操作進行。

1.6 細胞培養(yǎng) 本研究應用的肺癌細胞系A(chǔ)549細胞、HCC827細胞、NCI-H82細胞、NCI-H146細胞在DMEM完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，完全培養(yǎng)液中含有10%的胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）。培養(yǎng)條件為濕潤狀態(tài)下37oC和5%CO2。培養(yǎng)液用量：35 mm培養(yǎng)皿為2 mL培養(yǎng)液，60 mm培養(yǎng)皿為3 mL培養(yǎng)液，10 cm培養(yǎng)皿為8 mL培養(yǎng)液。細胞的凍存與復蘇：將細胞用適量的1.25%的胰酶消化，待細胞變圓、尚未漂起時候加入適量完全培養(yǎng)液并反復吹打形成細胞懸液。按照細胞懸液:甘油=900 μL:100 μL的比例混合，-70oC液氮中保存過夜。復蘇細胞時，在37oC水浴中迅速解凍細胞后加入適量的完全培養(yǎng)液。5 h-8 h后更換完全培養(yǎng)液并常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.7 CTC模型的建立及細胞捕獲效率實驗 制備NSCLC細胞系A(chǔ)549細胞、HCC827細胞、NCI-H1650細胞株、NCI-H3122細胞株的單細胞懸液，經(jīng)計數(shù)后分別以50、100、200、500、1,000共5個細胞數(shù)量梯度加入7.5 mL正常人全血中，模擬CTC，檢測制備的磁球捕獲CTC的能力。將待測模型的各分組細胞樣品進行1,000 rpm/min離心10 min；小心取中上層液置于EP管中，加入與其等量的PBS充分混勻。隨后加入EGFR和Vimentin及FA納米脂質(zhì)磁球20 μL，室溫下孵育15 min，每5 min混勻1次；將離心管插入磁分離架吸附10 min，吸棄上清液后加入10 μL 4%的多聚甲醛固定細胞10 min；使用PBS溶液對固定處理的捕獲CTC進行磁分離洗滌2次；加入10 μL FITC標記的CK19單克隆抗體（CK19-FITC）、20 μL DAPI染色液、10 μL PE標記的CD45抗體（CD45-PE），混勻后避光染色15 min；染色結(jié)束后，磁分離5 min，用去離子水洗滌兩次，充分洗掉未結(jié)合的抗體和DAPI；最后向離心管中加入15 μL去離子水重選CTC，混勻后的液體均勻涂于多聚賴氨酸處理的防脫載玻片，待液滴干于熒光顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.8 納米脂質(zhì)磁球?qū)Ψ伟┡R床血樣中CTC的分離鑒定 收集NSCLC患者7.5 mL抗凝血液，1,000 rpm離心10 min；小心取中上層液置于EP管中，加入與其等量的PBS充分混勻；加入免疫脂質(zhì)磁球20 μL，室溫孵育30 min，每10 min混勻一次；將EP管插入磁分離架上吸附5 min，吸棄上清液，加入10 μL 4%的多聚甲醛固定細胞10 min；PBS洗滌3次；加DAPI染色液30 μL、CK19-FITC染色液10 μL、CD45-PE染色液10 μL混勻避光染色15 min；PBS洗滌3次；向EP管中加入15 μL去離子水重懸，均勻涂于防脫載玻片，待液滴干后熒光顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，重復測量數(shù)據(jù)比較采用重復測量設(shè)計的方差分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫磁球的制備與肺癌CTC檢測 免疫磁性微球的制備流程見圖1。納米磁球系統(tǒng)由5種功能元素組成：（i）EGFR抗體衍生物、（ii）氧化鐵（Fe3O4）納米顆粒、（iii）Cholesterol及（iv）DOPC。EGFR抗體用作生物配體，以特異性捕獲在其膜上過表達EGFR受體的癌細胞亞群。超順磁性Fe3O4納米顆粒允許EGFR抗體捕獲細胞后的磁性分離，并且分離的CTC可以用免疫熒光進行鑒定。Vimentin和FA磁球的制備與EGFR相同。制備的蛋白抗體免疫磁性微球加入到肺癌患者外周血中，捕獲的肺癌CTC通過免疫熒光進行鑒定后計數(shù)。

2.2 免疫磁球的材料學表征及性能評價 Vimentin磁球的平均粒徑為491 nm，Zeta電位為+20.4 mv。FA磁球的平均粒徑為359 nm，Zeta電位為+16.5 mv。EGFR磁球的平均粒徑為436 nm，Zeta電位為+29.7 mv。本研究制備的磁球具有較小的粒徑和較高的穩(wěn)定性。EGFR、Vimentin和FA磁球的原子力顯微鏡觀察結(jié)果見圖2A，由圖可知，三種免疫磁性微球為大小不一的球形，沒有發(fā)生團聚現(xiàn)象，說明免疫磁性微球穩(wěn)定性較好，形狀較規(guī)則，大小在200 nm左右，具有脂質(zhì)體的囊泡特性。從圖2B中的紫外測試圖中可以發(fā)現(xiàn)，三種抗體免疫磁球約在276 nm處出現(xiàn)一個寬的吸收峰，表明磁球表面上確實接上了EGFR、Vimentin和FA。從圖2C中的普魯士藍染色結(jié)果可以明顯看到細胞表面呈現(xiàn)藍色。這是由于細胞表面包覆的免疫磁球被鐵質(zhì)的特異性染料-普魯士藍染色。由圖2C可知，本研究制備的三種免疫磁球與肺癌A549細胞具有較好的親和性。三種磁球?qū)Σ煌伟┘毎礎(chǔ)549細胞、HCC827細胞、NCI-H1650細胞株、NCI-H3122細胞株的捕獲效率如圖3所示。磁球?qū)Σ煌伟┘毎稻哂休^為穩(wěn)定的回收效率，EGFR、Vimentin和FA磁球平均捕獲效率分別為78.0%、79.0%和82.0%，同時使用三種磁球捕獲效率為91.0%。以上結(jié)果表明EGFR、Vimentin和FA磁球具有較高的肺癌細胞親和能力和比較穩(wěn)定的捕獲能力。

2.3 肺癌臨床血樣中循環(huán)腫瘤細胞的免疫熒光鑒定 將EGFR、Vimentin和FA免疫磁球分離出來的肺癌患者的CTC進行涂片觀察，其中在白光下具有明顯細胞形態(tài)，CK19-FITC綠色熒光為強陽性，DAPI藍色熒光為強陽性，2種熒光疊加后重合，且CD45染色不顯示熒光的細胞判定為肺癌CTC，如圖4所示。

2.4 CTC數(shù)量與患者的臨床特征的關(guān)系 在60例NSCLC患者中，每個肺癌患者血液中均能檢測到CTC，記CTC≥2為陽性，則CTC檢測陽性率為100.0%。圖5A是單獨分別使用三種磁球及聯(lián)合使用三種磁球?qū)?0例患者的CTC數(shù)量進行檢測，結(jié)果顯示使用單一磁球捕獲肺癌患者外周血中CTC時，三種磁球中葉酸磁球捕獲效果最好，而聯(lián)合使用三種磁球捕獲CTC效果更加顯著。使用EGFR、Vimentin和FA單一磁球分別捕獲和聯(lián)合使用三種磁球捕獲肺癌患者外周血中CTC，若以CTC≥2為CTC陽性，得到的CTC陽性率結(jié)果如圖5B所示，EGFR、Vimentin和FA捕獲的陽性率分別為65.0%、33.3%和93.3%，聯(lián)合使用三種磁球捕獲的陽性率為100.0%。與臨床信息的相關(guān)性分析見表1，聯(lián)合使用三種磁球檢出的CTC數(shù)量與臨床分期具有相關(guān)性。

3 討論

CTC檢測為癌癥患者的輔助診斷，治療效果評估和評價預后提供了一種新方法[22]。EpCAM已被廣泛的用于上皮型CTC的分離富集，然而CTC從組織進入血液傳播會發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），從而導致腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、耐藥和免疫逃避等，以EpCAM作為主要的捕獲工具的富集方式將影響EMT細胞的捕獲，導致假陰性率提高。腫瘤細胞的上皮型標示物（CK, EpCAM, E-cad）與間質(zhì)型標示物（Vimentin,N-cad, O-cad）經(jīng)歷著此消彼漲的動態(tài)變化，以EMT階段為例，CTC的間質(zhì)型蛋白呈現(xiàn)強表達，而上皮型蛋白則為弱或無表達[23]。通過選用Vimentin作為間質(zhì)型CTC標志物，采用Vimentin磁球捕獲高表達Vimentin的CTC，我們發(fā)現(xiàn)Vimentin磁球?qū)Ψ伟┘毎旮骷毎甑钠骄东@效率達到79%。

腫瘤細胞中存在EGFR信號傳導通路，如EGFR過度表達、EGFR突變等的異常，從而促進細胞不斷增殖并抑制其凋亡，導致生長調(diào)節(jié)失控。EGFR突變型患者對EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKIs）類藥物的有效率高，副作用輕，耐受性好，已成為晚期NSCLC的一線治療藥物。目前利用外周血循環(huán)腫瘤細胞檢測EGFR表達及突變已成為肺癌領(lǐng)域研究的熱點[24,25]。我們選用EGFR磁球捕獲高表達EGFR的CTC，發(fā)現(xiàn)EGFR磁球?qū)Ψ伟└骷毎甑钠骄东@效率達到78%。

FA是一種細胞表面糖蛋白，在多種癌癥中高度表達，尤其是在卵巢癌和肺癌中，其廣泛的被應用于CTC的分離富集[26,27]。我們選用FA磁球捕獲高表達FA的CTC，發(fā)現(xiàn)FA磁球?qū)Ψ伟└骷毎甑牟东@效率達到82%。通過EGFR、Vimentin、FA三種免疫脂質(zhì)體磁球特異性捕獲EGFR、Vimentin、FA三種分型的CTC，它們對肺癌各細胞株的平均捕獲效率分別為78.0%、79.0%、82.0%，結(jié)果表明單獨使用三種免疫脂質(zhì)磁球時，F(xiàn)A磁球有一個相對較高的捕獲效率，聯(lián)合使用三種磁球能夠達到一個更高的捕獲效率，平均捕獲效率為91.0%。將三種免疫脂質(zhì)體磁球應用于60例NSCLC患者中，對于我們建立的這套CTC分選系統(tǒng)，我們使用每7.5 mL血液中有2個CTC為cutoff值，EGFR、Vimentin、FA陽性率分別為65.0%、33.3%、93.3%，而聯(lián)合使用三種磁球捕獲CTC的陽性率為100.0%，結(jié)果表明聯(lián)合使用三種磁球?qū)TC有更高的檢出率，最后，我們將聯(lián)合使用三種磁球檢出的CTC總數(shù)與患者臨床信息進行相關(guān)性分析，采用5為分界值，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用三種磁球檢出的CTC數(shù)量與臨床分期具有相關(guān)性。

表1 磁球混合物檢出CTC總數(shù)與肺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性Tab 1 Correlation between total CTC and clinicopathological characteristics of lung cancer patients detected by magnetic ball mixture

圖1 免疫磁球的制備及CTC分離鑒定流程圖Fig 1 Immunomagnetic spheres preparation and CTC separation and identification flowchart. WBC: white blood cell.

我們利用基于EGFR、Vimentin、FA免疫脂質(zhì)體的磁性納米系統(tǒng)能夠有效捕獲EGFR+、Vimentin+、FA+過表達CTC，同時能夠從外周血細胞中分離捕獲的細胞進行免疫熒光鑒定，驗證我們的實驗結(jié)果。

本研究證實通過聯(lián)合使用EGFR、Vimentin和FA三種免疫脂質(zhì)磁球作為CTC捕獲的靶點，用以增加NSCLC CTC檢測的敏感性是新型實用的檢測手段。通過這個策略，更多異質(zhì)性CTC能夠被捕獲，可用于早期癌癥的診斷及其復發(fā)評估，同時發(fā)現(xiàn)檢出的CTC數(shù)量與臨床分期具有相關(guān)性。也正因為捕獲過程中并不會破壞循環(huán)腫瘤細胞的細胞膜，所以利用該方法捕獲的CTC能夠用于進一步的分析，包括單細胞測序等。盡管本實驗得到了一個很有希望的結(jié)果，但是其臨床有效性仍需進一步驗證。

圖2 Vimentin、FA、EGFR免疫脂質(zhì)磁球的表征。A：三種磁球的原子力顯微鏡觀察圖片；B：三種磁球的紫外吸收光譜圖；C：三種磁球的普魯士藍染色圖片。Fig 2 Characterization of Vimentin, FA, EGFR immunolipid magnetic spheres. A: Atomic force microscope observation picture of three magnetic spheres； B: Ultraviolet absorption spectra of three magnetic spheres； C: Prussian blue stained picture of three magnetic spheres； FA: folic acid； EGFR:epidermal growth factor receptor.

圖3 三種磁球（Vimentin、FA、EGFR）及其混合物對不同肺癌細胞的捕獲效率。A：A549細胞；B：HCC827細胞；C：NCI-H1650細胞；D：NCI-H3122細胞。Fig 3 Capture efficiency of three kinds of magnetic spheres (Vimentin, FA, EGFR) and their mixtures on different lung cancer cells. A: A549 cells； B:HCC827 cells； C: NCI-H1650 cells； D: NCI-H3122 cells.

圖4 Vimentin、EGFR、FA三種免疫脂質(zhì)磁球捕獲臨床血樣中CTC的熒光顯微鏡觀察結(jié)果。Fig 4 Vimentin, EGFR, and FA immunolipid magnetic spheres captured CTC in clinical blood samples for fluorescence microscopy observations.

圖5 三種磁球及其混合物捕獲的CTC數(shù)量與陽性率。A：三種磁球及其混合物捕獲肺癌患者血樣中的CTC數(shù)量統(tǒng)計；B：三種磁球及其混合物對肺癌患者CTC進行捕獲，以為CTC≥2為陽性，統(tǒng)計CTC陽性率。Fig 5 The number and positive rate of CTC captured by the three magnetic spheres and their mixtures. A: Statistics of CTC in blood samples of lung cancer patients captured by three magnetic spheres and their mixtures； B: Three magnetic spheres and their mixtures were used to capture CTC from patients with lung cancer. CTC≥2 was positive, and CTC positive rates were counted.

Author contributions

Li GL, Wang Y, Tan GL conceived and designed the study.Li GL, Wang Y, Tan GL, Liu Y, Xu Z, Feng H, Xing W, Xu ZF performed the experiments. Wang Y, Tan GL, Liu Y analyzed the data. Li GL, Wang Y, Tan GL, Liu Y, Xu Z contributed analysis tools. Li GL, Wang Y, Tan GL, Liu Y provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.